Western Blot（WB）實驗詳解

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。我們將通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術：

【原理】

與 Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

【分類】

western顯色的方法主要有以下幾種：

     i. 放射自顯影                        ii. 底物化學發(fā)光ECL                        iii. 底物熒光ECF                       iv. 底物DAB呈色

現(xiàn)在常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色，目前發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

【主要試劑】

30%丙烯酰胺混合液，1.5M Tris（pH 8.8），1.0M Tris（pH 6.8）,10%SDS，10%過硫酸銨(APS)，N,N,N',N'四甲基二乙胺(TEMED)等。

【主要步驟】

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