ELISA檢測中的OD值知多少？

“OD值”這個概念想必做實驗的各位小伙伴們都不陌生，從判斷提取核酸的質(zhì)量及濃度，到BCA蛋白定量進行蛋白定量，又或者是ELISA實驗檢測目的蛋白含量，這些常用的基礎實驗都需要檢測樣品的“OD值”，但是，“OD值”到底是個什么東西，我們在測量“OD值”的時候又有哪些需要注意的問題，今天就讓小編給小伙伴們好好說道說道。
 

什么是“OD”值？

OD全稱optical density，也就是光密度，也可以稱為吸光度。吸光度指的是利用物質(zhì)*的吸收光譜，來鑒別物質(zhì)或者測定物質(zhì)的含量，也就是將一束特定波長的光通過被檢測物，被檢測物可以將光吸收掉一部分，通過吸光度計算被檢測物的濃度。一般被檢測物濃度越高，吸光度的值就會越高。實驗中也是利用“OD值”和被檢測物的濃度之間的關(guān)系來根據(jù)吸光度。

了解了“OD值”是什么之后，接下來我們再看看在不同的實驗中測量“OD值”有哪些需要注意的。

需要注意的就是測量時的光波長。上文在介紹“OD值”概念時提到，吸光度利用的是物質(zhì)*的吸收光譜，實際操作中我們需要注意的關(guān)鍵的也是這一點，不同物質(zhì)的吸收光譜不同，大吸收峰的波長也不同，為了達到好的測量效果，一般來講，我們需要在待測物質(zhì)的大吸收波長處來檢測其“OD值”。例如，核酸在260nm波長處光吸收大，而蛋白和酚類物質(zhì)則在280nm波長處光吸收大；BCA法檢測蛋白含量時，顯色反應后，溶液由淺綠色變?yōu)樽仙藭r在560nm處有大光吸收值；TMB法顯色的ELISA實驗，在加入終止液后溶液由藍色變?yōu)辄S色，在450nm處有大光吸收。
 

除了吸收波長，一些實驗還需要設置校正波長，校正波長往往遠離大吸收波長，作為本底吸收，排除由于氣泡、灰塵等其他系統(tǒng)誤差造成的“OD值”偏差。根據(jù)測得的“OD值”，進行雙波長校正，可以有效的減少系統(tǒng)誤差造成的影響。

對于測量得到的待測樣本“OD值”還需要進行換算才可以得到終的濃度，有很多小伙伴往往在這一步出現(xiàn)錯誤，功虧一簣。需要注意的地方也比較簡單，就是根據(jù)對應試劑盒的說明書，采用推薦的曲線擬合方式進行擬合，擬合后需要看一下擬合曲線的R2值，約接近1證明曲線擬合度越高，結(jié)果越可信。如果R2值較低，則需要檢查是否出現(xiàn)標準品稀釋問題或?qū)嶒灢僮鞒霈F(xiàn)失誤。拿愛必信的試劑盒來舉例，BCA 蛋白定量試劑盒（abs9232），此款試劑盒推薦的標曲擬合方式就是直線擬合，而ELISA試劑盒系列產(chǎn)品，則推薦用四參數(shù)擬合方式進行標曲擬合。選擇錯誤的擬合方式，會影響曲線擬合度，R2值較低，回歸計算的待測樣品濃度也不準確。溫馨提示：BCA蛋白定量實驗以及ELISA實驗的顯色過程都是受反應時間及溫度等條件影響的，需要根據(jù)實驗情況及時終止實驗進行讀數(shù)，做實驗時盡量不要走開哦~
 

關(guān)于“OD值”本期就先分享到這，看到后的小伙伴們還有福利，小編在這里把一款小巧的曲線擬合軟件ELISA Calc分享給大家，常見的曲線擬合方式都在里面，幫助大家測好“OD值”，得到好結(jié)果。

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