ELISA實驗——我的OD去哪兒了？

在ELISA實驗中，最擔心遇到的結(jié)果，莫過于樣本中檢測不到想要的指標，或者是指標的吸光度落在檢測限之外，這時候應該怎么做呢？

一、超出檢測上限

這種情況比較常見于高表達的蛋白，稀釋了一百倍還是在標準曲線之外，這時候您需要參考相關的文獻，按照文獻的稀釋倍數(shù)去調(diào)整，但是因為樣本的不同，文獻的稀釋倍數(shù)也并不一定適合您的樣本，如果還是超出上限，繼續(xù)進行稀釋就可以。

二、低于檢測下限——信號太弱

往往是由于目標蛋白的濃度太低了，可能是稀釋倍數(shù)太高，也可能是本身目標蛋白含量就比較少。這種情況主要常見于在健康樣本中對炎癥因子的檢測，表達含量往往極低。

解決方案：

①首先降低稀釋倍數(shù)，一直降低到能夠檢測到有效的吸光度

②增加抗體的孵育時間。如果說明書寫著抗體需要在室溫孵育2小時，而得到的結(jié)果不好，嘗試在室溫兩小時孵育的基礎上再增加4°C孵育過夜，使得抗體結(jié)合，或增加抗體的量，說明書上只是推薦的量，有些樣本可能需要更多的抗體，進而提高檢測信號。

③將HRP濃度增加50%，或加倍，使得它在與TMB顯色底物反應時產(chǎn)生更強的顏色。

④ELISA盒子如果不是拿到手立即做實驗，保存的時候應該避光保存，使TMB底物性能。TMB孵育的時候需要把ELISA板放在黑暗中，因為TMB對光非常敏感。

⑤如果稀釋倍數(shù)已經(jīng)降低到樣本原液，且做了實驗的優(yōu)化，依舊不能檢測到，建議在實驗組別設置中添加陽性對照孔，用明確表達的樣品作為陽性對照，如果標準曲線及陽性樣品均可測得正常的表達濃度，則表明實驗成功，其余待測樣品表達含量低于檢測下限，在表中可記錄為0或標注低于檢測下限。

如程碧珍等人[1]在用ELISA檢測結(jié)核性胸膜炎患者（實驗組）和非感染性胸膜積液患者（對照組）胸腔積液和血清中的IL-17時，對照組患者胸膜積液中的IL-17水平低于檢測下限，濃度無法測出，但實驗組能明顯檢測到，因此將對照組記為△，標注低于檢測下限，如圖所示。

如果依舊想要檢測到或者需要做一個比較，可以選擇靈敏度更高的試劑盒，更低的檢測下限，就有更大的可能性能夠檢測到目的蛋白。

如果陽性對照孔都無法測到正常表達濃度，問題可能就是樣品本身，是否不適用于ELISA實驗，ELISA樣品一般選擇培養(yǎng)上清、血清、血漿，其他樣品形式可能并不適合，此時就要考慮更換樣品或者更換檢測手段。

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參考文獻：

[1]    程碧珍,林樹勇,張俏忻,楊禮,蔡應木.IL-17與IL-23免疫軸在結(jié)核性胸膜炎免疫致病機制中的作用[J].中國校醫(yī),2014,28(05):353-355.