基質(zhì)膠（OrganoGel）用于類器官3D體外培養(yǎng)操作手冊(cè)

圖 1.人膽管類器官在 A 公司的基質(zhì)膠和 OrganoGel 基質(zhì)膠中的生長(zhǎng)情況。人膽管類器官由細(xì)胞核染料 DAPI（藍(lán)色），緊密 連接蛋白抗體 anti-ZO1 和細(xì)胞骨架蛋白 F-actin 的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin 染色成像。

圖2. 人原發(fā)腸癌類器官在A公司的基質(zhì)膠和OrganoGel基質(zhì)膠中的生長(zhǎng)情況。

圖3. 肝癌類器官在A公司的基質(zhì)膠和OrganoGel基質(zhì)膠中的生長(zhǎng)情況。肝癌類器官由細(xì)胞核染料DAPI（藍(lán)色），肝臟細(xì)胞生物標(biāo)志物HNF4a和肝癌標(biāo)志物GPC3的抗體染色成像。

圖4. 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC 在 A 公司的基質(zhì)膠和 OrganoGel 基質(zhì)膠上均可形成血管網(wǎng)絡(luò)。HUVEC細(xì)胞由活細(xì)胞染料Calcein AM染色（綠色）成像。

一、 類器官培養(yǎng)（操作所需時(shí)間為 1 小時(shí)）

1. 將基質(zhì)膠于 4°C 冰箱里的冰上過夜解凍。

2. 將 24 孔板放置于培養(yǎng)箱預(yù)熱。

3. 用預(yù)冷的槍頭將解凍的基質(zhì)膠進(jìn)行分裝。

4. 準(zhǔn)備病人或者動(dòng)物組織（或者類器官）來源的，細(xì)胞總數(shù)為 1X105的單細(xì)胞懸液。300g 離心 5min。

5. 取 50µL 的 OrganoGel 基質(zhì)膠與離心所得的細(xì)胞進(jìn)行混勻。

6. 取出預(yù)熱的 24 孔板，立即將基質(zhì)膠與細(xì)胞的混合物滴加在孔板里，立即將 24 孔板放入培養(yǎng)箱。

7. 約 10min 后，基質(zhì)膠凝固后，向孔板里加入 500µL 類器官培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

二、腫瘤類器官藥敏實(shí)驗(yàn)（操作所需時(shí)間為 2 小時(shí)）

1. 將擴(kuò)增好足夠量的腫瘤類器官（實(shí)驗(yàn)組）以及正常類器官（對(duì)照組）用 4°C 預(yù)冷的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，緩慢機(jī)械吹打，促進(jìn)膠液化溶解，并保持類器官結(jié)構(gòu)完整（可用于懸浮培養(yǎng)于有 5%基質(zhì)膠溶液的基質(zhì)膠表面）（Guillen et al. 2022）?；蛘咄ㄟ^ TryplE 酶消化獲得單細(xì)胞懸液。

2. 離心收集類器官細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3. 加入 OrganoGel 基質(zhì)膠原液，與細(xì)胞進(jìn)行混勻。

4. 將細(xì)胞與膠的混合物，通過排槍加入 37°C 預(yù)熱過的 96 孔板，或者 384 孔板，立即將孔板放入培養(yǎng)箱。

5. 大約 10min 后，OrganoGel 基質(zhì)膠將凝固，加入相應(yīng)體積的類器官培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

6. 類器官形成后（如果是機(jī)械吹打，類器官將在傳代 24h 后就會(huì)形成；如果是酶消化，類器官會(huì)在 3-5 天 后形成），每個(gè)孔分別加入含有 PI 染料以及不同種類、不同濃度的待篩選的抗腫瘤藥物。

7. 用高內(nèi)涵顯微鏡上進(jìn)行活細(xì)胞成像，測(cè)定腫瘤類器官對(duì)各種藥物的敏感性。

三、免疫缺陷小鼠成瘤實(shí)驗(yàn)（操作所需時(shí)間為 1 小時(shí)）

1. 搜集用于注射小鼠的細(xì)胞 1X105個(gè)，以 1:1 的體積與 OrganoGel 基質(zhì)膠混合，為方便注射，建議每次注射總體積不低于 100µL。

2. 用脫毛器對(duì)小鼠注射部位皮膚進(jìn)行脫毛，然后用酒精棉球進(jìn)行消毒。

3. 用不帶針頭的 1mL 注射器將細(xì)胞和膠的混合物吸入針頭，再裝上 16g 的針頭（針頭內(nèi)直徑為 1.194mm）， 將混合物注射到皮下，或者大腿肌肉（針對(duì)代謝特別旺盛的腫瘤細(xì)胞）。

四、血管生成實(shí)驗(yàn)（以永生化 HUVEC 細(xì)胞系為例，操作所需時(shí)間為 1 小時(shí)）

1. 將*培養(yǎng)基換成饑餓細(xì)胞用培養(yǎng)基：加入含 0.2% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM 丙酮酸鈉，100U/ml 青 霉素和 100µg/ml 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 小時(shí)。

2. 將 OrganoGel 基質(zhì)膠均勻鋪滿 96 孔板底。注意：槍頭需提前預(yù)冷半小時(shí)。盡量在冰上操作，避免基質(zhì)膠過早固化，避免氣泡產(chǎn)生。

3. 將 96 孔板在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 30min，固化基質(zhì)膠。

4. 消化 HUVEC 細(xì)胞，并計(jì)數(shù)。

5. 將 200µL 的 HUVEC 細(xì)胞懸液（含 5X104個(gè)細(xì)胞）加于含基質(zhì)膠的 96 孔板中。將 96 孔板放于培養(yǎng)箱。

6. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)將于 3 至 12 小時(shí)間形成。

7. 在血管網(wǎng)絡(luò)形成最佳時(shí)間，小心去除培養(yǎng)基，并用加入含活細(xì)胞染料 1/1000 Calcein AM（綠色）的培養(yǎng) 基進(jìn)行染色，并用顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

五、神經(jīng)軸突 3D 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)（以大鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞為例，操作所需時(shí)間為 2 小時(shí)）

1. 取孕期 12-15 天的大鼠胚胎，用眼科剪和眼科鑷分離出大腦皮層于 4°C 預(yù)冷的 DMEM 培養(yǎng)基中。

2. 用吸管輕緩吹打，然后用 70µm 濾網(wǎng)過來，獲得單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3. 離心（300g，3min），棄上清。將細(xì)胞與 OrganoGel 基質(zhì)膠進(jìn)行混合，然后將基質(zhì)膠混合物滴加在 24 孔 板中，每孔 50µl。

4. 將 24 孔板放于培養(yǎng)箱，大約 10min 后，OrganoGel 基質(zhì)膠將凝固。加入 1mL 神經(jīng)元分化培養(yǎng)基：Neurobasal medium，2% B27, 2mM L-glutamine，5%FBS，20ng/mL EGF 和 20ng/mLbFGF，100U/mL penicillin 和 100 µg/mL streptomycin。第二天開始，就能觀察到有明顯的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。

5. 在第 7 天可觀察到大量的神經(jīng)突（Neurite）長(zhǎng)出。