細胞培養(yǎng)的步驟有哪些

　　細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細胞培養(yǎng)都是一個不可少的過程，細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模克隆。

　　細胞培養(yǎng)的步驟

　　1、復(fù) 蘇

　　細胞復(fù)蘇的原則：快速融化

　　必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。

　　實驗前準(zhǔn)備

　　將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。

　　細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用75%酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。

　　在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

　　取出凍存管

　　根據(jù)細胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細胞的對應(yīng)編號。

　　從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

　　迅速解凍

　　迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

　　約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

　　平衡離心

　　用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。

　　制備細胞懸液

　　吸棄上清液。

　　向離心管內(nèi)加入適量培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。

　　用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　細胞計數(shù)

　　細胞濃度以5×105/ml為宜。

　　培養(yǎng)細胞

　　將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h(或者24-48h)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間根據(jù)細胞情況而定。

　　記錄復(fù)蘇日期

　　2、傳 代

　　01、傳代密度過高

　　一旦細胞養(yǎng)太久至融合度過高(>90%)才傳代，容易使細胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞，即便再重新鋪盤傳代，細胞也無法回到原本的特性了。(如：單層細胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象)。

　　解決方案

　　盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤。

　　細胞融合度：在細胞培養(yǎng)中指的是細胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例。

　　02、傳代密度過低

　　哺乳動物貼壁培養(yǎng)細胞，若細胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠，就無法在細胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導(dǎo)并活化細胞；總體細胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。

　　解決方案

　　細胞傳代時，要進行準(zhǔn)確的細胞計數(shù)，確保鋪盤的密度。

　　3、凍 存

　　細胞凍存的基本原理：慢凍

　　手動降溫：將細胞依序放在4℃(30分鐘)、-20℃(1小時)、-80℃(過夜)后移至液氮中保存。

　　程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器(填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱)，使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃(過夜)，然后移至液氮中保存。

　　由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動降溫。

　　部分低溫保護劑在緩慢冷凍過程中雖然會保護細胞，但它們也會引起細胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會含有血清，血清是用來降低細胞毒性的，但血清也不是完整的。