免疫共沉淀實驗·基礎(chǔ)篇

※ 如何理解文獻中的結(jié)果？

各名稱解析：

IB：全稱immunoblotting，即免疫印跡，也就是常規(guī)的Western Blotting，用于顯示目的蛋白。

IP：全稱immunoprecipitation，即免疫沉淀，這一步主要是為了純化富集目的蛋白。

Input：全細胞裂解液，含有細胞內(nèi)所有的蛋白，可認為是陽性組。也就是處理完樣本得到的細胞裂解液，在做IP實驗之前，需要先跑WB，確認樣本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗體

IgG：Anti-A的同型對照抗體，即跟Anti-A同來源同種型，如Anti-A是兔來源IgG型，則同型對照抗體需要選擇Rabbit IgG（abs20035）

結(jié)果圖解析：

該結(jié)果是為驗證蛋白A與蛋白B是否存在相互作用。本實驗一共分為兩大組：Input組及IP組，其中IP組又分為IgG組（陰性對照組）和實驗組，并通過WB去驗證蛋白A和B在每一個組里面是否存在。由Input組的條帶可以得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B都是存在的，證明樣本處理提取蛋白的步驟沒有任何問題。陰性對照IgG組和實驗組平行進行免疫沉淀實驗，結(jié)果蛋白A與蛋白B均沒有條帶，說明利用IgG抗體沒有把蛋白A和B沉淀下來，證明蛋白A和B與IgG沒有結(jié)合，排除了蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性；而實驗組蛋白A和B均有條帶，表示利用蛋白A的抗體進行沉淀實驗，成功把蛋白A沉淀下來了，與此同時蛋白B也被沉淀下來，進而得到結(jié)論：蛋白A與蛋白B之間存在相互作用。

確切來說，試劑盒的50T代表著能夠完成50次免疫沉淀反應(yīng)，而實際上免疫共沉淀實驗需要設(shè)置多個組別進行對照驗證，因此具體能夠完成多少次Co-IP實驗由設(shè)計方案決定，一般至少需要設(shè)置陰性對照、陽性對照、實驗組三個組別。

這個步驟的目的是為去除樣本中可與protein A/G瓊脂糖珠非特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，減少干擾，非必做，如CoIP實驗中發(fā)現(xiàn)有較多雜帶，可考慮做一下；但應(yīng)注意，選擇此步驟后，需要消耗瓊脂糖珠，后續(xù)能夠進行免疫沉淀的次數(shù)也相應(yīng)減少。

對于內(nèi)源性Co-IP實驗，陰性結(jié)果不能說明無相互作用，也有可能是蛋白在細胞內(nèi)表達過低導(dǎo)致，因此建議先做過表達Co-IP作為對照。