多色結(jié)果不理想？快進(jìn)來(lái)看看是怎么個(gè)事兒

Q：我的結(jié)果拍出來(lái)全視野都是熒光信號(hào)（如下圖），這是怎么回事呀？

A：這個(gè)成像的情況多半是過(guò)曝啦！造成過(guò)曝的原因就是儀器的曝光時(shí)間設(shè)置不合適，我們的熒光染料強(qiáng)度比一般的染料都要強(qiáng)，且不容易淬滅，一般情況下在3-5ms的曝光時(shí)長(zhǎng)就能夠有熒光信號(hào)了，最長(zhǎng)也不會(huì)超過(guò)20ms（除非是放了很久發(fā)生淬滅的片子），您可以看一下您的顯微鏡/掃描儀的曝光時(shí)長(zhǎng)，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)全片都是熒光信號(hào)的情況。如果您不是手動(dòng)設(shè)置的曝光時(shí)長(zhǎng)，是儀器自動(dòng)曝光的，那出現(xiàn)這種情況有可能是您的陽(yáng)性信號(hào)太弱了，儀器在短曝光時(shí)長(zhǎng)沒(méi)有信號(hào)，所以自動(dòng)延長(zhǎng)了曝光時(shí)長(zhǎng)再拍，這就有可能把背景大量曝出來(lái)。您可以嘗試手動(dòng)進(jìn)行曝光時(shí)長(zhǎng)調(diào)整，如果縮短時(shí)長(zhǎng)以后背景變?nèi)醯?yáng)性信號(hào)也很弱，就需要調(diào)整抗體濃度和抗體孵育時(shí)間；如果縮短時(shí)長(zhǎng)以后背景依舊很強(qiáng)，請(qǐng)確認(rèn)染料是否孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，我們的染料孵育最長(zhǎng)不超過(guò)10min，甚至3-5min就已經(jīng)能夠孵育出信號(hào)了，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)全片都是信號(hào)的情況。

Q：我染出來(lái)的結(jié)果怎么有一些位置所有通道都有顏色？而且也不是陽(yáng)性信號(hào)

A：這個(gè)情況是因?yàn)檫@個(gè)位置壞死或者沒(méi)處理干凈，導(dǎo)致這種位置可能有大量蛋白碎片或者是組織液，亦或者是血液，這些雜質(zhì)都有可能吸附我們的TSA染料，染料的大量沉積，導(dǎo)致這些位置出現(xiàn)強(qiáng)非特異性。所以咱們?cè)谌〔牡臅r(shí)候，盡量避開(kāi)壞死區(qū)域，像灌流清潔這些前處理也要做好，樣本的質(zhì)量決定最終染色的質(zhì)量哦。（經(jīng)驗(yàn)之談：血細(xì)胞容易吸附短波長(zhǎng)的染料，如果有些樣本確實(shí)沒(méi)辦法灌流更干凈了，可以考慮避開(kāi)這些染料，至于具體是哪些染料，各廠家有些微區(qū)別，Absin這邊主要是TSA480容易吸附血細(xì)胞，如下圖）

Q：這個(gè)指標(biāo)我做免疫熒光的時(shí)候效果很好的，怎么你們多色做出來(lái)信號(hào)不對(duì)？

左IF；右mIHC

A：首先您需要確認(rèn)您的抗體是否有IHC應(yīng)用哦，如果您用的是IF的抗體，跟我們這個(gè)實(shí)驗(yàn)就不太符合哦，我們多色的熒光染料是獨(dú)立在抗體之外的，需要通過(guò)HRP的二抗去催化顯色，跟IHC里面用HRP二抗催化DAB顯色類(lèi)似，所以需要IHC應(yīng)用的抗體，免疫熒光則是把熒光素直接連接在抗體上，所以大家在一抗上面還是有些區(qū)別。另外，如果您手里的抗體廠家寫(xiě)了既能做IF也能做IHC，那我們多色的效果需要跟免疫組化（IHC）的效果去做對(duì)比哦，您可以染一個(gè)免疫組化看一下形態(tài)樣子、背景情況，看看跟多色是否相似，如果組化背景不干凈，多色也會(huì)有很高背景哦。

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