外泌體miRNA可通過(guò)細(xì)胞衰老途徑參與結(jié)腸炎發(fā)生？

外泌體是直徑為30-200nm的小囊泡，幾乎來(lái)自所有細(xì)胞^[1]。外泌體中包裹了RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，通過(guò)在不同細(xì)胞之間的傳遞，介導(dǎo)多種生理和病理過(guò)程。作為小的非編碼單鏈RNA，microRNAs (miRNAs)通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)，顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝，可以被包裝在外泌體中以防止RNase的消化并進(jìn)入循環(huán)，可作為潛在的疾病生物標(biāo)志物^[2]。

圖1 外泌體miRNA分泌機(jī)制

2023年8月7日，武漢大學(xué)人民醫(yī)院董衛(wèi)國(guó)教授團(tuán)隊(duì)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Gut Microbes在線發(fā)表了題為“Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinalepithelial cells promotes experimental colitisthrough regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway"研究性論文（IF 12.2）。該研究揭示了具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)通過(guò)外泌體加重潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的分子機(jī)制，為UC的診斷和靶向治療提供了新的理論支持。

圖2 文章信息

核梭桿菌(Fn)感染可加劇潰瘍性結(jié)腸炎(UC)。然而，F(xiàn)n感染的腸上皮細(xì)胞(IEC)衍生外泌體(Fn-Exo)與UC進(jìn)展之間的聯(lián)系尚未被研究。該研究通過(guò)miRNA測(cè)序鑒定了Fn-Exo和未感染的IEC衍生外泌體(Con-Exo)中差異表達(dá)的miRNA。然后，在體外和體內(nèi)確定Fn-Exo在UC發(fā)育中的生物學(xué)作用和機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)外泌體將miR-129-2-3p從Fn感染的IECs傳遞到未感染的IECs，加劇上皮屏障功能障礙和實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。機(jī)制上，F(xiàn)n-Exo通過(guò)miR-129-2-3p/TIMELESS軸誘導(dǎo)DNA損傷，隨后激活A(yù)TM/ATR/p53通路，最終促進(jìn)細(xì)胞衰老和結(jié)腸炎癥。總之，Exo-miR-129-2-3p/TIMELESS/ATM/ATR/p53通路加重了細(xì)胞衰老、屏障損傷和實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎。目前的研究揭示了Fn感染性UC進(jìn)展中的一個(gè)前所未知的調(diào)控途徑。此外，血清中的外泌體-miR-129-2-3p可能作為UC和Fn-high-UC的新型潛在診斷生物標(biāo)志物^[3]。

圖3 Fn-Exo在結(jié)腸炎中的作用和機(jī)制示意圖

一、愛(ài)必信擁有全套的外泌體&miRNA解決方案

圖4 愛(ài)必信外泌體&miRNA解決方案

1、miRNA提取

一般來(lái)說(shuō)，傳統(tǒng)的TRIzol及其它常用的RNA提取試劑盒提取的是較大分子的RNA，包括rRNA和mRNA，但對(duì)miRNA的提取效果不佳。這可能是因?yàn)槿绱诵〉暮怂岱肿硬灰妆淮碱惓恋?、也不易被核酸純化膜和磁珠吸附捕捉的原因。因而，要較好地提取miRNA，必須采取一些新的思路和方法。根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示，miRNA富集法應(yīng)該是一種不錯(cuò)的選擇。其原理為，先使用富集試劑將含量較低、分子量較小的miRNA聚集在一起，再使用核酸純化柱進(jìn)行提取。顯然，miRNA聚集后更加有利于miRNA的吸附和捕捉，從而得以有效地提升miRNA的提取得率。

愛(ài)必信研發(fā)了可高效提取各樣本中miRNA的專門試劑盒，與部分同類試劑盒相比，顯著提升了miRNA的提取效率。

1）采用特殊的消化技術(shù)，去除較大分子的DNA和rRNA, 使miRNA更容易分離提取
2）采用miRNA富集技術(shù)，使miRNA聚集起來(lái)，使之更容易被核酸純化膜吸附純化，大幅提升miRNA的提取效率；
3）操作簡(jiǎn)便，只需30多分鐘即可獲得理想的miRNA提取結(jié)果。

2、miRNA逆轉(zhuǎn)錄&qPCR

miRNA逆轉(zhuǎn)錄的難點(diǎn)在于其分子較小，逆轉(zhuǎn)錄引物無(wú)法理想地與miRNA結(jié)合。顯然，進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，需要對(duì)miRNA分子進(jìn)行加長(zhǎng)改造。有兩種方法可達(dá)到這一目的：一種采用Poly(A)加尾法，另一種采用莖環(huán)法。對(duì)于加尾法逆轉(zhuǎn)錄來(lái)說(shuō)，miRNA能否有效加長(zhǎng)的關(guān)鍵在于Poly(A)聚合酶的活性。Poly(A)聚合酶活性高，就可以在短時(shí)間內(nèi)給miRNA加上較長(zhǎng)的Poly(A)尾巴，使miRNA分子能夠高效地結(jié)合Oligo(dT)引物。另外Oligo(dT)引物的設(shè)計(jì)也至關(guān)重要，如果是簡(jiǎn)單的Oligo(dT)，引物與miRNA的結(jié)合往往會(huì)發(fā)生錯(cuò)位，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄效率降低。高效的Oligo(dT)引物應(yīng)該加入錨定堿基，從而使二者的結(jié)合更加特異高效。莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵在于莖環(huán)的設(shè)計(jì)，該莖環(huán)應(yīng)能高效地與miRNA 3’端特異、高效地結(jié)合，同時(shí)還要能夠順利地折疊和打開(kāi)。

miRNA qPCR相對(duì)較為簡(jiǎn)單，主要有染料法和探針?lè)?。兩種方法相比，探針?lè)ㄌ禺愋愿鼜?qiáng)。不過(guò)如果miRNA能夠高效提取，并且miRNA qPCR逆轉(zhuǎn)錄成功，無(wú)論miRNA qPCR選擇何種方法，一般都會(huì)有較為理想的結(jié)果。

二、加尾法逆轉(zhuǎn)錄VS頸環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄如何選擇？

選擇何種miRNA逆轉(zhuǎn)錄以及定量方法，主要由實(shí)驗(yàn)來(lái)決定。對(duì)于從事較多miRNA（3個(gè)以上）研究的研究者來(lái)說(shuō)，選用加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒較好，因?yàn)橐淮文孓D(zhuǎn)錄后可以進(jìn)行多個(gè)miRNA的qPCR擴(kuò)增，省去了很多的實(shí)驗(yàn)操作。但對(duì)于只檢測(cè)1-2個(gè)miRNA的研究者來(lái)說(shuō)，選用莖環(huán)法比較合適，因?yàn)榍o環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果更加特異。

需要特別注意的是，miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA qPCR試劑盒一般是配套使用的，研究者最好買我公司配套的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑和qPCR試劑，否則，有可能出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)失敗。其主要原因是逆轉(zhuǎn)錄引物上往往設(shè)計(jì)有qPCR引物結(jié)合序列，如果買不同廠家的試劑，qPCR引物可能無(wú)法特異地結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。另外，對(duì)于初學(xué)者而言，miRNA上游引物的設(shè)計(jì)有一定難度，往往既花了時(shí)間，又得不到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議最好購(gòu)買能夠贈(zèng)送上游引物的逆轉(zhuǎn)錄試劑生產(chǎn)廠家。

1）凡購(gòu)買miRNA逆轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒一套，即可免費(fèi)獲得逆轉(zhuǎn)錄&qpCR引物；
2）凡購(gòu)買miRNA逆轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒一套支持miRNA引物定制合成服務(wù)。

外泌體相關(guān)產(chǎn)品推薦

[1] Pegtel DM, Gould SJ. Exosomes. Annu Rev Biochem. 2019;88:487–514. doi: 10.1146/annurev-biochem-013118-111902.

[2] Jeppesen DK, Fenix AM, Franklin JL, Higginbotham JN, Zhang Q, Zimmerman LJ, Liebler DC, Ping J, Liu Q, Evans R, et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 2019;177(2):428–445.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.029.

[3] Wei S, Wu X, Chen M, Xiang Z, Li X, Zhang J, Dong W. Exosomal-miR-129-2-3p derived from Fusobacterium nucleatum-infected intestinal epithelial cells promotes experimental colitis through regulating TIMELESS-mediated cellular senescence pathway. Gut Microbes. 2023 Jan-Dec;15(1):2240035. doi: 10.1080/19490976.2023.2240035. PMID: 37550944; PMCID: PMC10411316.

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