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一、免疫熒光的原理

免疫熒光(Immunofluorescence，IF)技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。

二、IF分類(lèi)

三、IF實(shí)驗(yàn)流程

1）樣品準(zhǔn)備：對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌 (1000rpm、5min) 2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片；

2）固定：4%多聚甲醛(PFA)溶液固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3遍，每次5min；

3）通透：0.5% TritonX100，通透15-20min，PBS洗滌3遍，每次5min；

4）封閉：3%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉30min-1h ，封閉的作用是可以減少一抗和二抗與非靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行非特異性結(jié)合時(shí)所產(chǎn)生的本底信號(hào)；

5）抗孵育：封閉過(guò)后，不用洗，直接將多余的BSA吸走，用稀釋后的一抗（用3% BSA稀釋?zhuān)?度過(guò)夜孵育;

6）二抗孵育：PBST洗滌3遍，每次5min，洗去未結(jié)合的抗體。而后用稀釋后的二抗（用3% BSA稀釋?zhuān)┦覝乇芄夥跤?h，PBST洗滌3遍，每次5min；

7）細(xì)胞核染色：滴加DAPI避光染色5min，PBS洗滌3遍，每次5min（染細(xì)胞核是為了定位細(xì)胞）；

8）拍照：立即用激光共聚焦或熒光顯微鏡進(jìn)行拍照，如果需要等待，則避光放在4°保存。

四、檢測(cè)方法

檢測(cè)方法分為直接檢驗(yàn)和間接檢驗(yàn)，我們一般多采用間接檢驗(yàn)（一抗+二抗）的方式。

五、免疫熒光雙染

在同一組織細(xì)胞標(biāo)本上需要同時(shí)檢測(cè)兩種抗原時(shí)，需進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧p重免應(yīng)焚光標(biāo)記法也分為直接法和間接法。

1）直接法：將兩種不同熒光素偶聯(lián)的抗體（如抗A和抗B）以適當(dāng)比例混合，樣本孵育，潤(rùn)洗，封片，鏡檢；

特點(diǎn)：簡(jiǎn)便可靠，不需要考慮一抗種屬來(lái)源的問(wèn)題，但靈敏度較低。

2）間接法：用未標(biāo)記的兩種一抗薄育樣本，潤(rùn)洗后，加入兩種不同的熒光素偶聯(lián)的對(duì)應(yīng)二抗辯育樣本，潤(rùn)洗，封片，鏡檢；

3）特點(diǎn)：使用此法應(yīng)注意兩種特異性一抗必須來(lái)源于不同種屬，且熒光標(biāo)記二抗、一抗的種屬要相匹配。

六、IF注意事項(xiàng)

1）固定時(shí)間影響熒光固定效果，針對(duì)細(xì)胞樣品，如果用4%多聚甲醛固定，推薦固定時(shí)長(zhǎng)15min，時(shí)間太短沒(méi)有達(dá)到固定效果時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致甲醛被氧化成甲酸，沒(méi)有固定作用了；

2）保持醛固定液新鮮，否則自發(fā)熒光背景會(huì)升高；

3）使用抗體時(shí)，需要查詢說(shuō)明書(shū)。因?yàn)椴煌贵w使用場(chǎng)景不一樣，確認(rèn)抗體是否能用于細(xì)胞IF、冰凍切片IF、 石蠟切片IF；

4）細(xì)胞密度是整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵點(diǎn)之一。如果細(xì)胞數(shù)量太多，產(chǎn)生疊加，也會(huì)影響整體熒光效果；

5）洗滌過(guò)程輕柔，防止加液過(guò)程沖力過(guò)大丟失細(xì)胞；

6）通透時(shí)間一般為15-20min，過(guò)短過(guò)長(zhǎng)效果均不好，應(yīng)做不同時(shí)間梯度摸索。

七、IF常見(jiàn)問(wèn)題總結(jié)

1）信號(hào)微弱或沒(méi)有信號(hào)

2）高背景

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