類(lèi)器官免疫熒光整體染色法

一、類(lèi)器官收集及洗滌

1、類(lèi)器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組），加類(lèi)器官傳代緩沖液定容至10mL（緩沖液越多，基質(zhì)膠被稀釋的越充分，越容易去除），4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化，如果冰箱保溫效果強(qiáng)，冷凍3min），300g 4℃，離心5min棄上清。

2、類(lèi)器官清洗

添加1mL類(lèi)器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸，300g 4℃，離心5min棄上清。

二、類(lèi)器官免疫熒光染色

1）4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，每次2min；

2）0.5%Triton透膜20min，PBS洗3次，每次2min；（如果需檢測(cè)的目的蛋白屬于胞內(nèi)蛋白或者抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)位于胞內(nèi)的跨膜蛋白，抗體孵育前需進(jìn)行透膜處理）

3）1%BSA室溫封閉60min，PBS洗3次，每次2min；
4）5%BSA稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，每次2min；
5）5%BSA稀釋的TRITC標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1h，PBS洗3次，每次2min；
6）5ug/mLDAPI避光孵育15min，PBS洗3次，每次2min；
7）將類(lèi)器官輕柔鋪在載玻片上，吸水紙輕輕吸取多余殘留液體；
8）指甲油封片輕柔固定，于激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

注：PBS清洗時(shí)，可用槍頭輕輕吹起避免氣泡，待類(lèi)器官沉淀到底部開(kāi)始下一步操作。

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