神經(jīng)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)指南——B27

概念——Mckay于1997年在《Science》雜志上將神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的概念總結(jié)為：具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)細(xì)胞不能再生的傳統(tǒng)理論。

圖1 第3、5、7代神經(jīng)球巢蛋白免疫熒光染色(×400)免疫熒光染色陽(yáng)性圖片

特點(diǎn)——通過(guò)對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂兩種分裂方式完成自我更新，NSCs具有多向分化潛能，且不表達(dá)成熟抗原，不被免疫系統(tǒng)所識(shí)別，能通過(guò)血腦屏障，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。

應(yīng)用——神經(jīng)干細(xì)胞能夠趨向損傷部位，通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者分化為不同的細(xì)胞修復(fù)或補(bǔ)充受損神經(jīng)組織，神經(jīng)干細(xì)胞還可以作為基因載體，用于顱內(nèi)腫瘤和其它神經(jīng)疾病的基因治療，此外，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞可用于判斷藥效及藥物毒性，例如觀察某些化合物的神經(jīng)活性。目前美國(guó)臨床信息公示數(shù)據(jù)庫(kù)中，NSCs相關(guān)的臨床實(shí)驗(yàn)共有122例，涉及到了多發(fā)性硬化、帕金森病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、脊髓損傷等。

不對(duì)稱分裂：一種細(xì)胞分裂的方式，母細(xì)胞產(chǎn)生的兩個(gè)子細(xì)胞的類型各不相同。相反，對(duì)稱性分裂就是產(chǎn)生兩個(gè)相同的細(xì)胞。

神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)——許多研究表明采用無(wú)血清培養(yǎng)基，NSCs 可以穩(wěn)定在未分化狀態(tài)，而采用含血清培養(yǎng)基，NSCs 多數(shù)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。

B-27添加劑（50×，不含維生素A）abs9272是無(wú)血清添加劑，包含抗氧化劑、神經(jīng)細(xì)胞所需生長(zhǎng)因子、維生素（不含維生素A）和神經(jīng)元所需的脂肪酸等，以適宜比例配比，可應(yīng)用于大多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。無(wú)維生素 A型可防止干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，是神經(jīng)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)不能少的試劑。推薦搭配神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基(abs9460)進(jìn)行培養(yǎng)。 由于L-谷氨酰胺在水溶液中不穩(wěn)定，神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基和B-27中都未包含L-谷氨酰胺，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)須另外添加L-谷氨酰胺。

圖2 不同類型培養(yǎng)基(×100)形成4d神經(jīng)球的比較

A:無(wú)血清培養(yǎng)基含有B27(2%)原代培養(yǎng)4d；B:含血清培養(yǎng)基原代培養(yǎng)4d

培養(yǎng)基配置方案

1、置于4°C解凍本產(chǎn)品；
2、在使用前無(wú)菌添加2％本產(chǎn)品和5mM L-谷氨酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制成神經(jīng)元培養(yǎng)基注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積，并儲(chǔ)存在-20℃。避免反復(fù)凍融；
3、對(duì)于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，神經(jīng)元培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補(bǔ)充25μM的L-谷氨酸，在培養(yǎng)4天以后不再額外添加谷氨酸。配置好的培養(yǎng)基，可于2-8℃的避光可保存一周。

圖3 B-27添加劑（50×，不含維生素A） abs9272

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1、用預(yù)冷的0.05mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)皿表，每平方厘米表面使用0.15mL，室溫包被1h；
2、去除多聚賴氨酸溶液，并用無(wú)菌蒸餾水沖洗（多聚賴氨酸對(duì)細(xì)胞有毒性）。在超凈工作臺(tái)中打開(kāi)培養(yǎng)皿的蓋子通風(fēng)，直到干燥。培養(yǎng)皿干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周；
3、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室程序或隨細(xì)胞提供的說(shuō)明書(shū)分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元；
4、在預(yù)熱的（37℃）神經(jīng)元培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備) 接種細(xì)胞，建議的細(xì)胞密度為160個(gè)細(xì)胞/平方毫米, 或必要時(shí)使用自行優(yōu)化的細(xì)胞密度；
5、在37℃，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)；
6、培養(yǎng)4-24h后, 更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
7、對(duì)海馬神經(jīng)元以外的細(xì)胞：在接種4d后，更換一半體積的新鮮的培養(yǎng)基，之后每3d重復(fù)一次。 

對(duì)海馬神經(jīng)元：接種3d后，用不含L-谷氨酸的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每3d重復(fù)一次。 

注意：在培養(yǎng)基中添加25µM 2-Mercaptoethanol，可改善海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)期存活率。 

其他神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加物

除B27（50×，不含維生素A）外，含維生素的B27(abs9120)、N-2無(wú)血清添加劑(100×)(abs9121)，以及馬血清在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用都較為廣泛。

區(qū)別在于：N-2無(wú)血清添加劑是化學(xué)成分確定的添加劑，N-2 添加劑主要被推薦用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)來(lái)源的有絲分裂后期的神經(jīng)元的生長(zhǎng)和表達(dá)。B-27添加劑(50×)用于海馬神經(jīng)元和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和保持其短期或長(zhǎng)期活性。其中不含維生素A款，可防止干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，更適合神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖。很早之前就有研究人員對(duì)比過(guò)不同種類血清對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于胎牛和其他動(dòng)物血清，馬血清(abs989)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖的作用顯著，與胎牛血清相比，馬血清用于培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，具有非常高的性價(jià)比。

胞胞巴適本期推薦：

[1] 吳增,李媛,靳曉飛等.神經(jīng)干細(xì)胞提取與培養(yǎng)方法的比較研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2018,34(05):729-734.

[2] 于麗華,趙書(shū)平,席先成等.不同種類血清對(duì)新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的影響[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2002(03):190-192.

注：文中圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)或參考文獻(xiàn)，僅供學(xué)習(xí)參考用

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