線粒體功能障礙 | ATP檢測(cè)助力糖尿病心肌缺血-再灌注(MI/R)發(fā)病機(jī)制研究

2型糖尿病(T2D)是一種全球性威脅，影響著全球數(shù)百萬(wàn)人。T2D是心肌梗死的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素，導(dǎo)致心肌血運(yùn)重建后嚴(yán)重的左心室功能障礙，增加缺血-再灌注(I/R)損傷的風(fēng)險(xiǎn)，并使疾病發(fā)展復(fù)雜化。糖尿病心肌損傷加重的原因尚待闡明，線粒體功能損傷一直是研究的焦點(diǎn)。

有研究表明T2D增加心肌缺血-再灌注(MI/R)損傷易感性的機(jī)制包括：①T2D本身觸發(fā)高血糖和胰島素抵抗；②在缺血和再灌注期間誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥的釋放。這兩者都導(dǎo)致線粒體功能障礙。盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明線粒體功能障礙與其在T2D MI/R病理生理學(xué)中的作用有關(guān)，但通過(guò)靶向線粒體來(lái)對(duì)抗這種疾病的有效治療策略尚未實(shí)施。

圖1  糖尿病MI/R損傷發(fā)病機(jī)制研究圖形摘要^[1]

2023年8月3日，武漢大學(xué)人民醫(yī)院夏中元教授團(tuán)隊(duì)在Cell Communication and Signaling上發(fā)表題為“Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA"的研究論文。他們采用高脂飲食(HFD)加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病小鼠模型，心肌缺血2h再灌流30min建立MI/R模型，高糖(HG)和棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞糖脂毒性的細(xì)胞模型。研究闡明了cGAS-STING激活在糖尿病MI/R損傷的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用，該激活是由線粒體融合減少引起的胞漿線粒體DNA增加所觸發(fā)的。

圖2  rAAV-MFN2過(guò)表達(dá)調(diào)控糖尿病MI/R小鼠線粒體動(dòng)力學(xué)和功能。C：線粒體形態(tài)變化；E-H：心肌細(xì)胞總ATP生成量及COX Ⅰ、COX Ⅱ、COX Ⅴ活性^[1]。

夏中元教授團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)論為糖尿病MI/R損傷的治療提供了臨床前的見(jiàn)解。研究中，心肌細(xì)胞總ATP的檢測(cè)與定量使用了愛(ài)必信（上海）生物科技有限公司提供的ATP Microplate Assay Kit。

ATP檢測(cè)試劑盒(abs580117)使用方法介紹

適用范圍：尿液、血清、血漿、組織提取物、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞培養(yǎng)上清和其他生物液體樣品

檢測(cè)原理：

三磷酸腺苷(ATP)是細(xì)胞代謝的化學(xué)能，通常被稱為細(xì)胞的“能量貨幣"。ATP只在光合作用和細(xì)胞呼吸過(guò)程中產(chǎn)生，并在生物合成反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞分裂等細(xì)胞過(guò)程中消耗。它是細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)鍵指標(biāo)，在研究和藥物開(kāi)發(fā)中被用作衡量細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性的指標(biāo)。

ATP檢測(cè)試劑盒是一種靈敏的測(cè)定各種樣品中三磷酸腺苷的方法。三磷酸腺苷濃度由肌酸激酶和肌酸決定。反應(yīng)產(chǎn)物可以在660nm的比色讀數(shù)下測(cè)量。

備注：

1、反應(yīng)后溶液應(yīng)呈現(xiàn)黃色。如果沒(méi)有顏色，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)失敗。如果呈藍(lán)色，則說(shuō)明溶液受到污染。為了防止磷污染，最好使用一次性塑料容器來(lái)配制溶液。
2、Enzyme：使用前加入1mL蒸餾水溶解。
3、Substrate：使用前加入6mL蒸餾水并加熱至溶解。
4、Standard：使用前加入1mL蒸餾水充分溶解，然后取500μL加入500μL蒸餾水中，獲得濃度為5mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
5、Dye Reagent Working Solution：分別取5mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅰ中，1mL Dye Reagent Ⅲ加入到Dye Reagent Ⅱ中充分溶解。將所有Dye Reagent Ⅱ轉(zhuǎn)移到Dye Reagent Ⅲ中充分混合，然后將所有Dye Reagent Ⅰ轉(zhuǎn)移到Dye Reagent Ⅲ中（必須遵循這一步驟）。混合的染料試劑可在4℃保存2-3天。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、試劑和材料

1、自備試劑：蒸餾水
2、自備材料：酶標(biāo)儀、移液器與槍頭、離心管、離心機(jī)、計(jì)時(shí)器、濕冰等。

二、樣品處理

1、細(xì)胞/細(xì)菌樣品：將細(xì)胞或細(xì)菌（5×10⁶個(gè)）收集到離心管中，離心后去掉上清液，加入1mLAssay buffer，超聲處理（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），在4℃、8000g下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于濕冰上待檢測(cè)；
2、組織樣品：稱取1g組織，加入1mL Assay Buffer進(jìn)行超聲勻漿（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）后，在4℃、8000g下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于濕冰上待檢測(cè)；
3、血清/血漿樣品：直接置于濕冰上待檢測(cè)。

三、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

用蒸餾水對(duì)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品（2.5mmol/L）進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

四、樣品預(yù)實(shí)驗(yàn)

對(duì)于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內(nèi)變化。建議多做幾個(gè)稀釋梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確保讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

五、樣品檢測(cè)

使用前將所有試劑加熱至37℃。按照以下方式加樣并充分反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀在660nm下檢測(cè)吸光值。

六、樣品濃度計(jì)算

樣品濃度計(jì)算試劑盒說(shuō)明書(shū)中提供兩種計(jì)算方式：①標(biāo)準(zhǔn)曲線法；②公式法。

針對(duì)說(shuō)明書(shū)既有計(jì)算公式又有標(biāo)曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡(jiǎn)便算法。建議按照標(biāo)曲計(jì)算，雖然比較麻煩且耗費(fèi)試劑，但檢測(cè)結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。按照標(biāo)曲計(jì)算，每一次都需要重新做標(biāo)曲，因?yàn)檫@種反應(yīng)是一個(gè)變化的過(guò)程，檢測(cè)的數(shù)值會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間、溫度等產(chǎn)生變化。

圖3  ATP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線示例（檢測(cè)限：0.02mmol/L - 2.5mmol/L）

常見(jiàn)問(wèn)題解答

Q1：我的樣本是組織，按照說(shuō)明書(shū)提供的樣品處理方法收集上清進(jìn)行檢測(cè)，如何確認(rèn)上清稀釋倍數(shù)？

A1：由于待測(cè)樣品的ATP含量未知，建議選取合適的樣品點(diǎn)（2-3個(gè)）做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。

Q2：說(shuō)明書(shū)中提到混合后的染料試劑可在4℃ 保存2-3天，我要在2-3天內(nèi)把實(shí)驗(yàn)做完嗎？

A2：試劑盒中染料(Dye)溶解后易氧化變質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存會(huì)失效。建議老師多攢些樣品一次性檢測(cè)；如必須分次檢測(cè)，可以考慮單買(mǎi)組分。

Q3：ATP檢測(cè)試劑盒里面的檢測(cè)板可以拆分嗎？因?yàn)槿绻鲱A(yù)實(shí)驗(yàn)摸索稀釋倍數(shù)的話，可能只做幾個(gè)孔。

A3：板子不能拆分，但是可以用常規(guī)的96孔酶標(biāo)板替代做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

[1] Xiong Y, Leng Y, Tian H, et al. Decreased MFN2 activates the cGAS-STING pathway in diabetic myocardial ischaemia-reperfusion by triggering the release of mitochondrial DNA[J]. Molecular biology reports, Cell Communication and Signaling, 2023,21:192.  
[2] Xu J, Xiong A, Wang X,et al.Hyperoside attenuates pyrrolizidine alkaloids-induced liver injury by ameliorating TFEB-mediated mitochondrial dysfunction[J]. Archives of Pharmacal Research, 2023, 46(8):694-712. 
[3] CaoM J, Huang X W, Zou J L, et al. Attenuation of Microglial Activation and Pyroptosis by Inhibition of P2X7 Pathway Promotes Photoreceptor Survival in Experimental Retinal Detachment[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2023, 64(7):1-14.
[4] YeB, Pei Y T, Wang L J, et al. NAD+ supplementation prevents STING-induced senescence in CD8+ T cells by improving mitochondrial homeostasis[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2024,1-17.

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