WB內(nèi)參選擇指南

1、什么是內(nèi)參？

內(nèi)參是Western Blot實(shí)驗(yàn)中用于標(biāo)準(zhǔn)化和校正實(shí)驗(yàn)誤差的一類(lèi)蛋白質(zhì)。它們通常是在不同組織和細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定的蛋白質(zhì)，由管家基因編碼，常用作檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平變化時(shí)的參照物。

2、內(nèi)參在WB中的作用是什么？

校正實(shí)驗(yàn)誤差：內(nèi)參用于校正蛋白質(zhì)定量和上樣過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)誤差，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于不同的樣品在蛋白質(zhì)提取、定量、上樣等步驟中可能存在操作誤差，使用內(nèi)參可以對(duì)這些誤差進(jìn)行校正。

半定量分析：通過(guò)比較內(nèi)參和目標(biāo)蛋白的信號(hào)強(qiáng)度，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量，然后將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量，用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析。

作為空白對(duì)照：內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否wan全，以及整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。

確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性：在比較不同條件下或不同組織中目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少時(shí)，內(nèi)參提供了一個(gè)參照標(biāo)準(zhǔn)，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。

3、常見(jiàn)的WB內(nèi)參有哪些？

β-Actin：β-肌動(dòng)蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白，分子量42KDa左右，廣泛分布于各種組織中，表達(dá)量豐富且相對(duì)恒定。它通常用作總蛋白的內(nèi)參，尤其是在非肌肉組織中。然而，需要注意的是，β-Actin在某些特定組織（如心?。┲械谋磉_(dá)量可能較低，因此并非在所有情況下都適用。此外，不同的β-Actin亞型在不同組織中的分布也有所不同，選擇抗體時(shí)需考慮這一點(diǎn)。

大鼠腦裂解物20μg 

人結(jié)腸癌組織

Hela細(xì)胞 

abs171598 Rabbit anti-β-Actin Monoclonal Antibody

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）：36kD左右，GAPDH是一種廣泛表達(dá)的蛋白，適用于多種細(xì)胞類(lèi)型。然而，在某些條件下，如缺氧或糖尿病，GAPDH的表達(dá)可能會(huì)受到影響，因此需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件謹(jǐn)慎選擇。

1: HeLa whole cell lysate 20ug Lane

2: THP-1 whole cell lysate 20ug Lane

 3: MCF7 whole cell lysate 20ug Lane

4: NIH/3T3 whole cell lysate 20ug Lane

5: mouse spleen lysate 20ug Lane

 6: C6 whole cell lysate 20ug Lane

7: rat spleen lysate 20ug 

abs132004 Rabbit anti-GAPDH Polyclonal Antibody

β-Tubulin：55kDa左右，β-Tubulin是微管蛋白的一種，參與構(gòu)成細(xì)胞骨架。由于其在細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，尤其用于檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白時(shí)。β-Tubulin的表達(dá)在多種細(xì)胞類(lèi)型中相對(duì)恒定，但同樣需要考慮特定條件下的表達(dá)變化，如在凋亡細(xì)胞中。

Hela細(xì)胞全裂解物

大鼠腎組織

NIH3T3細(xì)胞

abs171597 Rabbit anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody

除了以上介紹的內(nèi)參以外，還有α-Tubulin、Hsp90等等，每個(gè)內(nèi)參的分子量及適用情況不一樣，建議選擇之前做好功課。

4、如何挑選合適的內(nèi)參，需要考慮哪些因素？

目的蛋白分子量：內(nèi)參蛋白的分子量應(yīng)與目標(biāo)蛋白的分子量相差至少5kDa以上，以確保在凝膠電泳和Western Blot中能夠清晰地區(qū)分目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的條帶。

樣本種屬來(lái)源：不同種屬的樣本可能需要選擇不同的內(nèi)參蛋白。例如，哺乳動(dòng)物的組織或細(xì)胞樣本常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH等，而植物樣本可能選擇plant actin、Rubisco等作為內(nèi)參。

細(xì)胞定位：根據(jù)目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位選擇相應(yīng)的內(nèi)參。例如，如果是檢測(cè)全細(xì)胞或細(xì)胞質(zhì)蛋白，可以選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH等；如果是核蛋白，則可能選擇Lamin B、Histone H3等作為內(nèi)參。

實(shí)驗(yàn)環(huán)境：內(nèi)參的選擇還需要考慮實(shí)際的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和樣品的前處理。在某些特殊條件下，一些內(nèi)參蛋白的表達(dá)可能會(huì)發(fā)生變化，從而影響其作為內(nèi)參的穩(wěn)定性和可靠性。例如，在缺氧或糖尿病等條件下，GAPDH的表達(dá)可能會(huì)增加，因此可能不適合作為內(nèi)參。

組織特異性：不同的組織可能需要選擇不同的內(nèi)參。例如，肌肉組織中可能需要選擇特定的肌動(dòng)蛋白亞型作為內(nèi)參，而在非肌肉組織中則可能選擇β-actin等。

5、內(nèi)參抗體和目標(biāo)抗體如何孵育？

順序孵育：在檢測(cè)完目標(biāo)蛋白后，使用strip緩沖液洗掉膜上的抗體，然后重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體溫育和顯色檢測(cè)。這種方法需要在兩次孵育過(guò)程中使用同一張膜。

雙膜法：在蛋白轉(zhuǎn)膜后，根據(jù)預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪成大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開(kāi)。然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行孵育和顯色。

同時(shí)孵育（如果分子量相差較大）：如果目的蛋白的分子量與內(nèi)參蛋白的分子量相差較大，可以在轉(zhuǎn)膜后的同一張膜上同時(shí)進(jìn)行兩種抗體的孵育。由于條帶位置的差異，可以在同一張膜上分別檢測(cè)內(nèi)參和目標(biāo)蛋白。

使用標(biāo)記內(nèi)參抗體：有些實(shí)驗(yàn)室使用預(yù)先標(biāo)記有酶（如HRP）的內(nèi)參抗體，這樣可以在二抗孵育時(shí)加入這種標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作進(jìn)行顯色。

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