類器官&腫瘤球&細(xì)胞增殖、活力、毒性檢測全攻略

一、概述

在生物醫(yī)學(xué)研究的廣闊領(lǐng)域中，細(xì)胞活性檢測扮演著至關(guān)重要的角色。它不僅幫助科學(xué)家們評估細(xì)胞的生存狀態(tài)，還能深入了解細(xì)胞對藥物、環(huán)境變化或病理過程的響應(yīng)。類器官/腫瘤球/細(xì)胞活性檢測通常包括測量細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡等方面。今天，小愛向大家介紹器官/腫瘤球/細(xì)胞活性檢測的六大常用方法：細(xì)胞代謝檢測方法、DNA合成檢測方法、細(xì)胞ATP檢測方法、熒光染料檢測方法、細(xì)胞膜通透性檢測方法、細(xì)胞LDH檢測方法。

細(xì)胞增殖、活力、毒性檢測方法大全

二、檢測方法

1、細(xì)胞代謝檢測方法

基于細(xì)胞代謝物進(jìn)行的檢測方法有CCK8法(abs50003)、MTT法(abs50010)、MTS法(abs50011)、WST-1法(abs44133679)、XTT法(abs42088663)。今天，小愛給大家著重比較一下CCK8法和MTT法。

cck-8法和MTT法都是適合大規(guī)模、快速評價藥物的方法。與MTT相比較，cck-8法優(yōu)勢明顯。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，cck-8檢測OD值與活細(xì)胞數(shù)的線性關(guān)系比MTT法明顯。而且，MTT法產(chǎn)生不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶，需要有機(jī)溶劑DMSO溶解，操作過程中常會出現(xiàn)溶解不wan全或細(xì)胞丟失的現(xiàn)象，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。cck-8法只是加染料的一步操作，操作簡單，檢測可實時，免去了去除培養(yǎng)基的操作，是細(xì)胞增殖、活力、毒性的主流方法。對環(huán)境保護(hù)更為有利，不使用有機(jī)溶劑DMSO，所需的耗材也少。

下邊是兩個檢測試劑盒的各方面優(yōu)勢比較：

2、DNA合成檢測方法

基于DNA合成進(jìn)行的檢測方法有Brdu法(abs811906)、EdU-488法(abs50050)、EdU-555法(abs50051)、EdU-594法(abs50052)、EdU-647法(abs50053)。今天，小愛給大家著重介紹一下EDU法。

EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2'-脫氧尿苷，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見，在細(xì)胞增殖時能夠替代胸苷（胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine）插入正在復(fù)制的DNA分子中， EdU上的乙炔基能與熒光標(biāo)記的小分子疊氮化物探針（如Azide Alexa Fluor 488等）通過一價銅離子催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點(diǎn)擊反應(yīng)(Clickreaction)，從而可以進(jìn)行高效快速的檢測細(xì)胞增殖，特別是可以有效地檢測處于S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比， EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，不需要嚴(yán)格的樣品變性（酸解、熱解、酶解）處理，有效地避免了樣品損傷，有助于在組織、器官的整體水平上觀測細(xì)胞增殖的真實情況，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。

3、細(xì)胞ATP檢測方法

基于細(xì)胞ATP進(jìn)行的檢測方法有2D-ATP法(abs50065)（細(xì)胞適用）；3D-ATP法(abs50057)（類器官、腫瘤球適用）；2D/3D-ATP法(abs50059)（細(xì)胞、類器官、腫瘤球均適用）。今天，小愛給大家著重比較一下這3種方法的異同點(diǎn)。

相同點(diǎn)：以上3種方法均是借助ATP依賴的熒光素酶催化的熒光素發(fā)光反應(yīng)，通過化學(xué)發(fā)光信號測定細(xì)胞內(nèi)ATP含量，從而檢測細(xì)胞活力或定量檢測活細(xì)胞數(shù)目，檢測線性范圍寬、靈敏度高、穩(wěn)定性好。96孔板中，在100個至100,000個細(xì)胞范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，但不同細(xì)胞的檢測數(shù)量上限會有不同。此外，操作簡單，試劑盒中提供的檢測試劑為即用型，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測速度快，完成檢測僅需約10min，無需洗滌細(xì)胞，也無需更換或去除培養(yǎng)液。

不同點(diǎn)：2D-ATP法(abs50065)適用于2D細(xì)胞培養(yǎng)體系；而像類器官/腫瘤球這種介于細(xì)胞和組織之間的結(jié)構(gòu)需要裂解能力更強(qiáng)的ATP檢測試劑盒，故3D-ATP法(abs50057)采用的試劑裂解能力更強(qiáng)，適用于類器官、腫瘤球的ATP檢測；而2D/3D-ATP法(abs50059)是一款通用型試劑，兼具細(xì)胞、類器官、腫瘤球檢測功能，通用性更強(qiáng)。有關(guān)類器官、腫瘤球ATP檢測攻略可以查看鏈接3D腫瘤球&類器官藥敏活性檢測攻略。

4、熒光染料檢測

基于熒光染料進(jìn)行的檢測方法有活細(xì)胞示蹤法(abs50060)、活/死細(xì)胞雙染法(abs50056)（類器官、腫瘤球常用）、CFSE染色法(abs9106)、Calcein AM染色法(abs42014734)。今天，小愛給大家著重介紹一下活細(xì)胞示蹤法和活/死細(xì)胞雙染法。

（1）活細(xì)胞示蹤法

研究細(xì)胞運(yùn)動和定位，需要用到對活細(xì)胞無毒的專一性探針。Live Cell Tracking Kit提供了一種通用且保存良好的細(xì)胞跟蹤試劑(Cell Tracker Green)，用于監(jiān)測細(xì)胞的運(yùn)動，定位，增殖，遷移，趨化性和侵襲性。Cell Tracker Green是一種活細(xì)胞熒光示蹤探針，可以通過被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)蛋白共價結(jié)合，是一種長效細(xì)胞示蹤染料。一旦進(jìn)入細(xì)胞，非熒光性的Cell Tracker Green會被胞內(nèi)酯酶水解，產(chǎn)生綠色熒光(Ex/Em=494/521nm)。這些熒光產(chǎn)物只能積聚在具有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞中，因此死細(xì)胞和無完整細(xì)胞膜不能被染色。Cell Tracker Green對pH變化不敏感，可以由甲醛或戊二醛固定。Cell Tracker Green探針可以在活細(xì)胞中保留好幾代，并可以顯示熒光至少一周。探針可被轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞，但是不轉(zhuǎn)移到群體中的相鄰細(xì)胞。

（2）活/死細(xì)胞雙染法

在類器官的培養(yǎng)過程中，如果我們想了解類器官的增殖及凋亡狀態(tài)，可以通過對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，通過熒光顯微鏡拍照觀察。

Calcein-AM是一種對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光(Ex=490nm，Em=515nm)。因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA）相比，由于Calcein-AM細(xì)胞毒性極低，是較適合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化丙啶(PI)等聯(lián)合使用，同時進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光雙重染色。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，僅能穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光(Ex=535nm，Em=617nm)，因此PI僅對死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。

活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒(abs50056)的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系，以24孔板，每孔25uL類器官基質(zhì)膠凝聚物為例，每孔添加500uL染色工作液進(jìn)行染色。具體實驗步驟可參考鏈接類器官原位活死染色實驗攻略。

5、細(xì)胞膜通透性檢測

基于細(xì)胞膜通透性進(jìn)行的檢測方法有臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測試劑盒(abs50036)、伊紅染液(abs9222)、中性紅染色液（0.33%，活細(xì)胞染色用）(abs42154867)。

臺盼藍(lán)或伊紅染色法，是利用正常的健康細(xì)胞能夠排斥臺盼藍(lán)或伊紅，而喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞可以被臺盼藍(lán)或伊紅染色。臺盼藍(lán)或伊紅染色檢測的是細(xì)胞膜的完整性，通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。臺盼藍(lán)或伊紅染色后，通過顯微鏡下直接計數(shù)或顯微鏡下拍照后計數(shù)，就可以對細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量。

中性紅是一種弱堿性染料，同時也是一個pH指示劑，其變色范圍在pH值6.4至8.0之間（由紅變黃）。中性紅染色常用于鑒定動物細(xì)胞的死活?；罴?xì)胞被染成紅色，而死細(xì)胞則不變色，這種方法與臺盼藍(lán)染色法相反。通過測定細(xì)胞對中性紅的攝入量，可以評估細(xì)胞的增殖或毒性情況。

6、細(xì)胞LDH檢測

基于細(xì)胞LDH進(jìn)行的檢測方法是LDH法(abs580007)。LDH檢測的原理基于乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，簡稱LDH）的特性。以下是LDH檢測試劑盒(abs580007)的詳細(xì)原理：

（1）LDH的分布與釋放：LDH是一種廣泛存在于各種生物體中的穩(wěn)定的胞漿酶，正常情況下不能通過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞受到損傷或死亡時，細(xì)胞膜的完整性被破壞，LDH被釋放到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。

（2）LDH活性的測定：LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，同時在這個過程中，NAD+被還原生成NADH。NADH和四唑鹽類化合物INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)在硫辛酰胺脫氫酶(Diaphorase)的催化下反應(yīng)生成紅色的甲臜(Formazan)。

（3）顏色變化與細(xì)胞損傷的關(guān)系：甲臜的量與裂解（死亡）的細(xì)胞數(shù)成正比。在490nm波長下，甲臜產(chǎn)生吸收峰，可以通過比色來檢測細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞裂解液等樣品中LDH的活性。吸光度與LDH活性成線性正相關(guān)，即與裂解（死亡）細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。

（4）實驗操作：實驗中，將不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)液離心，將上清液移到96孔板中，加入LDH檢測試劑，反應(yīng)一定時間后可以通過酶標(biāo)儀或分光光度計測定釋放的LDH活性。通過比較不同組細(xì)胞釋放的LDH活性可以判斷細(xì)胞損傷情況的大小。

（5）應(yīng)用：LDH釋放檢測主要應(yīng)用于評估細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡情況，在藥物篩選、毒理學(xué)研究、細(xì)胞培養(yǎng)中都有廣泛的應(yīng)用。同時，在一些疾病的診斷和治療中，如心肌梗塞、肝炎、癌癥等也有一定的參考價值。

綜上所述，LDH檢測是一種通過測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性來評估細(xì)胞損傷程度的方法，其靈敏度、方便性和精確性使其成為細(xì)胞毒性分析中的一個重要工具。

今天講解就到這了，大家如有細(xì)胞和類器官實驗問題，歡迎一起交流哦！

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