三步構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型：ox-LDL誘導(dǎo)損傷/泡沫/鈣化全攻略

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種危害人類健康的慢性心血管疾病，是老年人最常見的死亡原因之一。AS 的主要病變特征是部分動(dòng)脈的脂質(zhì)沉積，并伴有平滑肌細(xì)胞（SMCs）和纖維基質(zhì)增生，逐漸發(fā)展為 AS 斑塊。

血管鈣化（VC）是一種以磷酸鈣沉積在動(dòng)脈和靜脈壁為特征的病理現(xiàn)象。動(dòng)脈粥樣硬化（AS）、糖尿病和慢性腎病的患者均有發(fā)生 VC 的巨大風(fēng)險(xiǎn)。

氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）在血管壁中的積累在 AS 和 VC 的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。有研究表明在 AS 腦梗死患者血清中檢測(cè)到了高表達(dá)的 ox-LDL，并認(rèn)為其可加速患者頸動(dòng)脈斑塊形成，促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊脫落，是腦血管病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，ox-LDL 作為關(guān)鍵的致病因子，是AS的有效模型。

（注：圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）

AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，細(xì)胞損傷、泡沫化、鈣化等過(guò)程相互交織、相互影響，不存在一個(gè)絕對(duì)的、一成不變的順序，但一般認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的起始步驟。在高血脂、高血壓、吸煙、糖尿病等多種因素作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，其通透性增加，血液中的脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞等得以進(jìn)入內(nèi)皮下。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，血液中的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等脂質(zhì)進(jìn)入內(nèi)皮下間隙，被氧化修飾形成ox-LDL，。ox-LDL被巨噬細(xì)胞吞噬，在細(xì)胞內(nèi)形成大量脂滴，巨噬細(xì)胞從而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞聚集是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變。隨著動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，平滑肌細(xì)胞在病變部位增殖、遷移并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)。在這一過(guò)程中，局部的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡等釋放出一些促鈣化因子，如堿性磷酸酶等，促進(jìn)鈣鹽在血管壁沉積，導(dǎo)致血管鈣化。鈣化通常發(fā)生在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成之后，使血管壁變硬、變脆，進(jìn)一步加重血管病變。

一、ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs損傷模型

1、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVECs（購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC）

2、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷方法

①HUVECs接種后，用不同濃度PFE（1.5、3.0、7.5 μg/mL）預(yù)處理 2小時(shí)（注：PFE是從芫荽種子中提取的黃酮類化合物）。
②ox-LDL刺激：移除預(yù)處理培養(yǎng)基，加入含100 μg/mL ox-LDL（abs47014903）的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng) 24小時(shí)，誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷。

此模型通過(guò)ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮炎癥和黏附分子表達(dá)(圖1)，模擬動(dòng)脈粥樣硬化早期內(nèi)皮損傷，適用于抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物（如PFE）的機(jī)制研究。

圖1  PFE通過(guò)抑制NF-kB途徑來(lái)抑制ox-LDL刺激的HUVECs炎癥

二、ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7泡沫化模型

1、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

巨噬細(xì)胞系 RAW 264.7（購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC）

2、誘導(dǎo)泡沫化方法

①實(shí)驗(yàn)組先用 PFE（從芫荽種子中提取的黃酮類化合物）（1.5、3.0、7.5 μg/mL）預(yù)處理 2 小時(shí)。對(duì)照組不加 PFE。
②ox-LDL 刺激：添加 ox-LDL（abs47014903）至終濃度 100 μg/mL，與細(xì)胞共孵育 24 小時(shí)。
檢測(cè)指標(biāo)：油紅 O（abs42024259）染色觀察脂質(zhì)積累（泡沫化程度）。RT-PCR/Western blot 檢測(cè)膽固醇流入（LOX-1、CXCL16）和流出（ABCA1、ABCG1、SR-B1）相關(guān)基因表達(dá)（圖2）。

此模型通過(guò)ox-LDL成功誘導(dǎo) RAW 264.7 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，并證實(shí)藥物PFE通過(guò)PPARγ-ABCA1/ABCG1 通路促進(jìn)膽固醇流出，抑制泡沫化。

圖2 PFE改善泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)積聚（泡沫細(xì)胞的代表性圖像用油紅O染色）

三、ox-LDL誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞SMCs鈣化模型

1、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞 HA-SMCs（購(gòu)自中國(guó) CTCC細(xì)胞庫(kù)）

2、鈣化造模方法

①將 HA-SMCs分為對(duì)照組及鈣化造模組，傳代后的細(xì)胞饑餓 24小時(shí)后，對(duì)照組換wan全培養(yǎng)基；
②造模組換鈣化培養(yǎng)基：10mmol/L β-甘油磷酸（abs812987） + 50μg/mL L-抗壞血酸（abs811910） + 100nmol/L地塞米松（abs813595）；并加入 50μg/mL濃度的 ox-LDL（abs47014903）誘導(dǎo)細(xì)胞 14天；
③茜素紅S（abs42012987）染色結(jié)果顯示鈣化造模組較對(duì)照組出現(xiàn)明顯的橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，鈣化模型建立成功。

此模型通過(guò)篩選ox-LDL的最佳誘導(dǎo)濃度建立SMCs鈣化模型（圖 3），適用于研究特定抗炎因子（如IL-37）對(duì)該模型鈣化進(jìn)程的影響及其分子機(jī)制。

圖3 茜素紅鈣化染色

在動(dòng)脈粥樣硬化研究的漫漫征途中，ox-LDL 無(wú)疑是我們手中的一把 “金鑰匙"。通過(guò)上述精心設(shè)計(jì)的細(xì)胞模型構(gòu)建方法，我們能夠深入探尋其在疾病進(jìn)展中的奧秘。而 Absin 作為您科研之路的堅(jiān)實(shí)后盾，所提供的各類優(yōu)質(zhì)試劑與產(chǎn)品，將助力您在動(dòng)脈粥樣硬化研究領(lǐng)域乘風(fēng)破浪，不斷取得新的突破與成果。

參考文獻(xiàn):

[1]Liu J, Zhang W, Li Y, Li X, Li Y, Guo F. Flavonoids extract from the seeds of Psoralea corylifolia L. (PFE) alleviates atherosclerosis in high-fat diet-induced LDLR-/- mice. Phytomedicine. 2022;98:153983.
doi:10.1016/j.phymed.2022.153983
[2]馬晨越. IL-37抑制人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣化并參與抑制其成骨轉(zhuǎn)化的研究[D]. 安徽醫(yī)科大學(xué), 2023.

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