人淋巴細(xì)胞分離液：原理、應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)指南

在免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和傳染病學(xué)等領(lǐng)域，人淋巴細(xì)胞分離液是不可huo缺的實(shí)驗(yàn)工具。這種基于密度梯度離心原理的溶液，能快速?gòu)膹?fù)雜的人外周血中分離出高純度的淋巴細(xì)胞，為后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)、免疫表型分析和功能實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

一、了解人淋巴細(xì)胞分離液

人淋巴細(xì)胞分離液，也稱為淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)（Lymphocyte Separation Medium, LSM），是一種根據(jù)血細(xì)胞密度差異設(shè)計(jì)的密度梯度離心溶液。

它的密度被精確調(diào)配在1.077±0.001g/mL范圍內(nèi)，與人淋巴細(xì)胞的密度（1.075-1.090g/mL）相近，而區(qū)別于紅細(xì)胞、粒細(xì)胞的密度（約1.090g/mL）和血小板的密度（1.030-1.035g/mL）。

這種分離液主要由聚蔗糖400（Ficoll 400）和泛影酸鈉（Sodium diatrizoate）按特定比例混合而成。

聚蔗糖構(gòu)成溶液的主體密度，而泛影酸鈉則提供適當(dāng)?shù)臐B透壓（280-340mOsm/kg H2O）和pH值（7.0-7.5），保持細(xì)胞在分離過(guò)程中的活性。

一般的人淋巴細(xì)胞分離液多是無(wú)菌過(guò)濾溶液，內(nèi)毒素水平極低（≤0.5EU/ml），適用于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

Absin人淋巴細(xì)胞分離液（#abs930）

二、分離原理揭秘

人淋巴細(xì)胞分離液的工作機(jī)制基于密度梯度離心原理，巧妙地利用了不同血細(xì)胞之間存在的自然密度差異。

當(dāng)稀釋后的抗凝全血輕輕鋪在分離液上層并進(jìn)行離心時(shí)，不同密度的血細(xì)胞會(huì)在離心力作用下在分離液中重新分布：

• 最上層：密度最小的血漿和血小板（密度約1.030g/mL）

• 第二層：淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（密度1.075-1.090g/mL）集中在血漿與分離液交界處，形成環(huán)狀乳白色層（常稱為“白膜層"）

• ? 第三層：透明的分離液本身

• ? 最di層：密度最da的紅細(xì)胞和粒細(xì)胞（密度約1.090g/mL）

這種分層現(xiàn)象使得研究人員能夠輕松地獲取高純度的淋巴細(xì)胞群體。

根據(jù)產(chǎn)品性能數(shù)據(jù)，使用人淋巴細(xì)胞分離液獲得的淋巴細(xì)胞純度通常大于90%，細(xì)胞存活率超過(guò)90%，提取率約為80%左右。

三、主要應(yīng)用領(lǐng)域

人淋巴細(xì)胞分離液在生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，是許多實(shí)驗(yàn)的起點(diǎn)。

1、在免疫學(xué)基礎(chǔ)研究中，它是獲取淋巴細(xì)胞進(jìn)行功能分析、亞群分類和細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定的shou選方法。淋巴細(xì)胞是體內(nèi)免疫系統(tǒng)的核心組成部分，T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫，B淋巴細(xì)胞參與體液免疫，NK細(xì)胞則能直接殺傷異常細(xì)胞。
2、在臨床診斷領(lǐng)域，這種分離液用于制備人淋巴細(xì)胞國(guó)家參考品，可用于人T/B/NK淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)。
3、腫瘤學(xué)研究同樣離不開(kāi)淋巴細(xì)胞分離液。在腫瘤細(xì)胞學(xué)檢查中，常規(guī)離心涂片背景污濁，腫瘤細(xì)胞少不易查到，而用淋巴細(xì)胞分離液提取的涂片背景清晰，腫瘤細(xì)胞多，易查到。這顯著提高了腫瘤診斷的準(zhǔn)確率，一次就能查到腫瘤細(xì)胞。
4、新興的細(xì)胞免疫療法如CAR-T（嵌合抗原受體T細(xì)胞）治療，其di一步也是使用淋巴細(xì)胞分離液從患者外周血中分離出T淋巴細(xì)胞。

四、實(shí)驗(yàn)操作指南

掌握正確的操作方法對(duì)獲得高質(zhì)量的淋巴細(xì)胞至關(guān)重要，以下是主要步驟：

1、樣本準(zhǔn)備：采集新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可），在采血后2小時(shí)內(nèi)開(kāi)始分離操作。用等體積的PBS或全血及組織稀釋液稀釋全血。
2、密度梯度離心：在離心管中加入適量分離液（最少3mL），將稀釋后的血液小心鋪在分離液上層，保持界面清晰。在室溫下，以500-1000g的離心力離心20-30分鐘。
3、細(xì)胞收集：離心后，用吸管小心吸取白膜層（淋巴細(xì)胞層）到潔凈離心管中，加入10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌細(xì)胞，以250g離心10分鐘。
4、細(xì)胞洗滌：棄上清，用5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g離心10分鐘，重復(fù)洗滌一次。
5、細(xì)胞重懸：棄上清，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求用適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

操作中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)：

• 溫度控制：分離液和樣本需保持在18-25℃的環(huán)境中。溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致分離液密度升高，可能造成紅細(xì)胞污染；溫度過(guò)高則會(huì)使密度降低，影響淋巴細(xì)胞回收率。

• 稀釋液選擇：不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液，這些離子會(huì)引起血細(xì)胞凝集，降低細(xì)胞得率和純度。

• 離心管材質(zhì)：部分塑料制品（如聚苯乙烯）因靜電作用可能導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，推薦使用聚丙烯離心管或未經(jīng)堿處理的玻璃離心管。

五、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

即使按照標(biāo)準(zhǔn)流程操作，實(shí)驗(yàn)中仍可能遇到各種問(wèn)題，以下是常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法：

• 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層：通常原因是轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短，可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)速。

• 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中：這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可適當(dāng)減低轉(zhuǎn)速。

• 離心后白膜層彌散：往往是由于細(xì)胞密度過(guò)大，可適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度。

• 離心后白膜層太淺或看不見(jiàn)：這是因?yàn)榧?xì)胞密度過(guò)小，同樣需要調(diào)整細(xì)胞密度。

• 淋巴細(xì)胞回收率低：檢查血液新鮮度，陳舊血液分離效果差；確保使用無(wú)靜電離心管；優(yōu)化離心條件。

• 紅細(xì)胞污染嚴(yán)重：可能是分離溫度過(guò)低，需確保實(shí)驗(yàn)在20℃左右進(jìn)行；避免吸取時(shí)帶入下層液體。

最后，人淋巴細(xì)胞分離液看似簡(jiǎn)單，卻是連接宏觀血液樣本與微觀細(xì)胞世界的橋梁。掌握了它的工作原理和使用技巧，就等于掌握了開(kāi)啟免疫細(xì)胞研究大門(mén)的鑰匙。

在CAR-T細(xì)胞治療等前沿領(lǐng)域，這一傳統(tǒng)技術(shù)仍在為革命性醫(yī)療突破提供基礎(chǔ)支持。

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