2×預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速PCR反應(yīng)體系

        2×預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速PCR反應(yīng)體系是采用 SYBR Green I 嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的專用 2×濃度預(yù)混液。本產(chǎn)品含有優(yōu)化濃度的HotStart Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+、反應(yīng)緩沖液和穩(wěn)定劑等成分。主要用于基因組 DNA 靶 序列和 RNA 反轉(zhuǎn)錄后 cDNA 靶序列的檢測。HotStart Taq DNA Polymerase 高溫加熱前，抗 Taq單克隆抗體與 Taq 結(jié)合，抑制 Taq 的聚合酶活性，從而抑制在低溫條件下出現(xiàn)的由引物和模板 DNA 非特異性雜交或引物二聚體引起的非特 異性擴(kuò)增?？贵w在 PCR 反應(yīng)的預(yù)變性步驟中已wan全失活，不會(huì)阻礙之后 Taq 酶聚合反應(yīng)，大大提高了 PCR 反應(yīng)的靈敏度及特 異性。 優(yōu)化濃度的 SYBR Green I 熒光染料摻入 DNA 雙鏈后，熒光信號(hào)增強(qiáng)，而不摻入鏈中 SYBR Green I 染料分子熒光信號(hào)不 變，從而保證熒光信號(hào)的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加wan全同步，熒光可以在退火或延伸階段測定。
       2×預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速PCR反應(yīng)體系為 2×濃度預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速 PCR 反應(yīng)體系，使用時(shí)只需加入模板、引物、ROX Reference Dye（用以校正孔與 孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差，根據(jù)不同熒光定量 PCR 儀選擇使用）和水，使其工作濃度為 1×，即可進(jìn)行反應(yīng)。具有快速簡便、 靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可最大限度地減少人為誤差、節(jié)約 PCR 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間、降低污染機(jī)率。

用戶需自備的試劑：cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。
請按照不同品牌熒光定量PCR儀的使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
操作示例：分別以20 µ l和50 µ l PCR反應(yīng)體系為例：
1、PCR 反應(yīng)體系的建立：

*模板量： 10-100 ng基因組DNA，或 1-10 ng cDNA 為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反應(yīng)的cDNA（ RT 反應(yīng)液）作為模板時(shí)的添加量不要超過 PCR 反應(yīng)液總體積的10% 。
*引物：通常引物濃度以 0.2 μM 可以得到較好結(jié)果，可以終濃度 0.1-1.0 μM 作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。為了獲得理想的 qPCR 的效果，擴(kuò)增片段的長度建議為 80-200 bp 。
*不同儀器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，請根據(jù)儀器說明進(jìn)行操作。
2、PCR 反應(yīng)條件的設(shè)置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗體封閉的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反應(yīng) 前進(jìn)行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃、2 min，復(fù)雜或高GC模板適當(dāng)延長時(shí)間至5 min。該DNA聚合酶在15 s內(nèi)可完成至 少300 bp的擴(kuò)增，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實(shí)驗(yàn)；對(duì)于超過350 bp或者高GC含量的擴(kuò)增子，建議增加延伸時(shí)間至60 s或者 采用三步法以提高擴(kuò)增效率。

 

注 ： 以上舉例為常規(guī) qPCR
反應(yīng)系統(tǒng)，僅供參考。實(shí)際反應(yīng)條件因模板、引物等的結(jié)構(gòu)不同而各異 ， 需根據(jù)模板、引物、目的片段的特點(diǎn)設(shè)定最佳反應(yīng)條件，并根據(jù)比例放大或縮小反應(yīng)體系。
3、在相應(yīng)的 real time PCR 儀器上完成實(shí)驗(yàn)，并分析結(jié)果。

-20℃避光保存，保質(zhì)期 24 個(gè)月，避免反復(fù)凍融。如果經(jīng)常使用，可置于 4℃保存至少 3 個(gè)月。

1、使用前請上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。
2、盡可能減少 RealStar Green Fast Mixture 在光下的曝露時(shí)間，長時(shí)間的曝光可導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱。
3、反應(yīng)液的配制、分裝請一定使用無污染的槍頭、Microtube 等，盡量避免交叉污染。
4、本品不能用于雜交探針法。