支原體染色檢測(cè)試劑盒

溶液

 1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
（1）對(duì)于貼壁細(xì)胞，在六孔板或其它多孔板內(nèi)或蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞至 50%-80%滿。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)滿會(huì)導(dǎo)致很難判斷是否存在支原體污染。
（2）對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，取少量細(xì)胞做細(xì)胞涂片，空氣中充分晾干。
2、用 PBS 按照 1:10 稀釋 Hoechst 染色液(1 體積 Hoechst 染色液加入 9 體積 PBS)。稀釋后的 Hoechst 染色液宜在 24h 內(nèi)使用。
3、加適量固定液固定 10~20min。 對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，加入 1mL 固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行洗滌。對(duì)于貼壁細(xì)胞，固定前需去除培養(yǎng)液。
4、去除固定液，空氣中晾干。
5、加適量 10 倍稀釋的 Hoechst 染色液室溫染色 10~30min。 對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，加入 1mL 染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時(shí)注意避光。可以用鋁箔紙避光。
6、去除染色液，空氣中晾干。
7、滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍(lán)色熒光。 熒光顯微鏡觀察時(shí)需 400 倍或 1000 倍放大觀察(需使用油鏡)。 沒(méi)有支原體污染或其它原核生物污染的細(xì)胞樣品，僅觀察到細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，線粒體 DNA 不會(huì)被染色。
有支原體污染的細(xì)胞樣品可觀察到細(xì)胞核周圍微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。 支原體污染嚴(yán)重的細(xì)胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。
有細(xì)菌、酵母或霉菌污染的情況雖然 Hoechst 染色也會(huì)呈陽(yáng)性，但細(xì)菌、酵母或霉菌污染在 光學(xué)顯微鏡下可以觀察到，而支原體觀察不到，由此可以初步區(qū)分是支原體還是其它微生物。
如有必要進(jìn)一步鑒定，可以通過(guò)把支原體接種培養(yǎng)和 RT-PCR 等方法進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。

1、Hoechst染色液為DMSO溶液，4℃時(shí)會(huì)凝固為固態(tài)，可室溫或37度烘箱融化后使用。
2、Hoechst 染色試劑對(duì)人體有害，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
3、固定液含有冰乙酸，有刺激性氣味，宜在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行固定操作。
4、熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測(cè)。
5、檢測(cè)支原體前最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng) 2~3 代，這樣更容易檢測(cè)出支原體，因?yàn)橐恍┛股乜梢砸种浦гw生長(zhǎng)。

2~8℃避光保存，有效期12個(gè)月。