Human CXCL10/IP-10 ELISA Kit

二、試劑準(zhǔn)備
檢測前請將所有的試劑、樣本恢復(fù)至室溫（25℃±3℃)。
如果濃縮的試劑出現(xiàn)結(jié)晶，37℃溫浴，直至結(jié)晶全部溶解。
1、1×洗液
吸取 20×濃縮洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸餾水至 1,000 ml，輕輕混勻，避免泡沫。轉(zhuǎn)移至干凈瓶內(nèi)。2 -8℃貯存， 1×洗液可穩(wěn)定保存 30 天。
2、1×檢測緩沖液
吸取 10×濃縮檢測緩沖液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸餾水至 50 ml ，輕輕混勻，避免泡沫。2 - 8℃貯存，1×檢測緩沖 液可穩(wěn)定保存 30 天。
3、檢測抗體工作液
稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1 ：100 稀釋濃縮的檢測抗體。
 4、鏈霉親和素工作液
稀釋前充分混勻。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣本的數(shù)量，用 1×檢測緩沖液按 1 ：100 稀釋濃縮的鏈霉親和素。

注意：檢測抗體工作液、鏈霉親和素工作液均應(yīng)在 30 分鐘內(nèi)使用。 
5、樣本稀釋
為了保證實(shí)驗(yàn)成功，由于對樣本的處理方式，培養(yǎng)條件等不同，建議shou次使用本試劑盒前*行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)以摸 索最佳的樣本濃度，避免因過濃使顯色反應(yīng)超出酶標(biāo)儀的檢測上限或稀釋倍數(shù)過大低于試劑盒靈敏度。 對于樣本的稀 釋，請用 1×檢測緩沖液稀釋血清/血漿樣本，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞培養(yǎng)上清。
6、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
開蓋前短暫離心，用蒸餾水重溶標(biāo)準(zhǔn)品，重溶體積標(biāo)注于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶 后標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 4,000 pg/ml 。重溶后靜置 10 - 30 分鐘。稀釋前充分混勻。
請使用聚丙烯管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。
7、血清/血漿樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
取 230 μl 濃縮的標(biāo)準(zhǔn)品，加入 230 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度 (2,000 pg/ml)。在每一個試管中加入 230 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1 ：1 系列稀釋。每次移液時(shí)，請確保充分混勻。以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。
8、細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
取 230 μl 濃縮的標(biāo)準(zhǔn)品，加入 230 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度(2,000 pg/ml)。在每一個試管中加入 230 μl 細(xì)胞培養(yǎng)基。使用高濃度標(biāo)準(zhǔn)品做 1 ：1 系列稀釋。每次移液時(shí)，確保充分混勻。以細(xì)胞培養(yǎng)基作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零濃度。

三、檢測步驟
檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫（25℃±3℃)。
（1)   準(zhǔn)備好所有需要的試劑及工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品。
（2)   將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口。
（3)    浸泡酶標(biāo)板：加入 300 μl 1×洗液靜置浸泡30 秒。為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果浸泡是必須的。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微 孔板拍干。洗板完成之后，請立即使用微孔板，不要讓微孔板干燥。
（4)   加標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻卓准尤?100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基(細(xì) 胞培養(yǎng)上清樣本)。
（5)   加樣本：血清/血漿：樣本孔加入 50 μl 1×檢測緩沖液和 50 μl 樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入 100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清。
（6)    加檢測抗體：每孔加入50 μl“檢測抗體工作液"(參見試劑準(zhǔn)備)。保證步驟 4 、5 、6 連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在 15 分鐘內(nèi)完成。
（7)   孵育：使用封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃) 孵育 2 小時(shí)。
（8)   洗滌：棄掉液體，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗滌 6 次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實(shí)驗(yàn)性能，必 須che底移除殘留液體。
（9)    加酶孵育：每孔加入 100 μl “鏈霉親和素工作液"(參見試劑準(zhǔn)備)。
（10) 孵育：使用新的封板膜封板。100-300 轉(zhuǎn)/分鐘振蕩（保證每孔溶液不撒出且能充分混勻即可），室溫（25℃±3℃) 孵育 45 分鐘。
（11)  洗滌：重復(fù)步驟 8。
（12) 加底物顯色：每孔加入 100 μl 顯色底物，避光，室溫（25℃±3℃) 孵育 5 - 30 分鐘。
（13) 加終止液：每孔加入 100 μl 終止液。顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕 叩擊板框，充分混勻。
（14) 檢測讀數(shù)：在 30 分鐘之內(nèi)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測，測定 450 nm 最大吸收波長和 570 nm 或 630 nm參考波長 下的 OD 值。校準(zhǔn)后的 OD 值為 450 nm 的測定值減去 570 nm 或 630 nm 的測定值。僅使用 450 nm 測定會導(dǎo)致 OD 值偏高，并且準(zhǔn)確度降低。

如何控制標(biāo)曲顯色？(僅針對雙抗夾心法 ELISA 試劑盒)
5 - 30 分鐘顯色時(shí)間為經(jīng)驗(yàn)范圍，每個具體的實(shí)驗(yàn)，可根據(jù)以下情況，確定大致的顯色時(shí)間：
1)    肉眼觀察：標(biāo)曲 S5 孔有淡藍(lán)色、Blank 孔無明顯藍(lán)色時(shí)，即可終止；
2)   儀器判斷：630 nm 左右波長下，標(biāo)曲 S1 孔的 OD 值達(dá)到 0.5 - 0.7 、S5 孔的 OD 值達(dá)到 0.05 - 0.08 、Blank 孔的 OD 值小于 0.05 時(shí)，即可終止；
3)   高敏系列試劑盒因靈敏度更高，需嚴(yán)格控制顯色時(shí)長，可較普通試劑盒適當(dāng)縮短顯色時(shí)間。

 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
1、結(jié)果計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的平均 OD 值，然后減去零濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值。
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行回歸擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w分析確定最佳擬合曲線。 通過對濃度值和 OD 值取對數(shù)擬合，可以對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性化。此過程可能可以得到更多樣本的濃度，但數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確 度會降低一些。
注意：標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的終濃度為 2,000 pg/ml。
如果血清/血漿樣本按照說明書進(jìn)行稀釋，最終的稀釋倍數(shù)為 2。如果樣本進(jìn)行了其它方式的稀釋，計(jì)算樣本濃度時(shí)請乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
2、典型數(shù)據(jù)
 每次檢測，每塊酶標(biāo)板都必須設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線。下面的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅作為示例參考。
3、靈敏度
人 IP-10 的zui低可檢測濃度為 3.50 pg/ml (6 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)。
10 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩倍 SD ，計(jì)算zui低可檢測濃度。
4、精密度
酶標(biāo)板內(nèi)精密度
3 個已知濃度的樣本酶標(biāo)板內(nèi)重復(fù)測定 20 次，評估酶標(biāo)板內(nèi)的精密度。
酶標(biāo)板間精密度
3 個已知濃度的樣本酶標(biāo)板間重復(fù)檢測6 次，評估酶標(biāo)板間的精密度。

5.   回收率
5 份健康人血清中加入 3 個不同濃度水平的人 IP-10，未加人 IP-10 的血清作為本底，計(jì)算回收率。回收率的范圍從 78 %至 114 % ，平均回收率為 93 %。
6.  稀釋線性
5 份健康人血清中加入高濃度的人 IP-10，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線的動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行系列稀釋，評估檢測的線性。

7.  校準(zhǔn)
本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品為聯(lián)科生物校準(zhǔn)的高純度重組人 IP-10。
8.  樣本值
應(yīng)用本試劑盒，檢測30 份健康志愿者的血清樣本，志愿者的用藥史不詳。

n.d. =  測不到濃度值。樣本的濃度值低于靈敏度被認(rèn)為測不到濃度值。
注意:  此樣本值范圍非生理值范圍。健康人樣本的濃度范圍因種屬、樣本制備以及檢測人員、設(shè)備的不同而有所不同。  以上數(shù)據(jù)僅供參考。

9.    特異性
本試劑盒識別天然和重組人 IP-10 。下述因子進(jìn)行了特異性的評估，沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)和干擾影響。