Mouse TGF-beta 1 ELISA Kit

CEDLAP, DPD1, latency-associated peptide, TGF beta1, TGFB, TGFB1, TGF-beta 1 protein, TGFbeta 1, TGF-beta 1, TGFbeta, TGF-beta-1, transforming growth factor beta-1, transforming growth factor, beta

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自備試驗(yàn)器材
1. 酶標(biāo)儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)
5. 500mL量筒

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 樣品收集及儲存
細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時(shí)檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)┦占獫{，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時(shí)檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 檢測前準(zhǔn)備工作（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測）
1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+240mL蒸餾水定容至200mL，實(shí)際操作時(shí)可先計(jì)算使用量，再進(jìn)行配制。
顯色劑：按每孔100 µL，計(jì)算當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當(dāng)日使用。
稀釋用緩沖液（1×）：試劑盒中為濃縮稀釋用緩沖液，應(yīng)取49.3ml的1X洗滌液再加入0.7ml濃縮稀釋緩沖液，混勻即為1X工作液。
SA-HRP： SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100 µL。例：使用了10個(gè)孔，則取25μL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1ml的1×工作濃度的檢測抗體。
檢測抗體：檢測抗體的重溶體積請參考瓶身標(biāo)簽，用稀釋用緩沖液重懸至相應(yīng)體積。
標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品的重溶體積請參考瓶身標(biāo)簽， 得到濃度為 2,000 pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少 15 分鐘，其充分溶解。（標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)過活化處理，無需再次活化）每個(gè)稀釋管中加入 500μL 稀釋液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋， 每管須充分混勻后再移液到下一管。   沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)（2,000 pg/mL） ， 稀釋液（1×） 可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)（0 pg/mL） 。1、準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2、從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3、分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔 100 mL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育 2 小時(shí)。
4、將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液 300 mL， 然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作 3 次。每次洗板盡量吸去殘留液體會(huì)有助于得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪茫谖埮母伤袣埩粢后w；
5、在每個(gè)微孔內(nèi)加入 100 mL 檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育 2 小時(shí)；
6、重復(fù)第 4 步洗板操作；
7、在每個(gè)微孔內(nèi)加入 100μL 稀釋好的鏈霉親和素-HRP，室溫孵育 20 分鐘。注意避光；
8、重復(fù)第 4 步洗板操作；
9、在每個(gè)微孔內(nèi)加入 100 mL 顯色底物，室溫孵育 5-30 分鐘（一般情況下孵育時(shí)間在15 分鐘左右會(huì)得到較好的結(jié)果，但請根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況謹(jǐn)慎選擇終止顯色的時(shí)間）。注意避光；
10、在每個(gè)微孔內(nèi)加入 50 mL 終止液，孔內(nèi)溶液顏色會(huì)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
11、加入終止液后 30 分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量 450 nm 的吸光度值，設(shè)定 540 nm 或 570nm 作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正， 結(jié)果準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響；
12、計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品 OD 值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng) OD 值對數(shù)生成曲線， 并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

三、試劑盒參數(shù)
1. 靈敏度：小鼠 TGF-beta 1 的zui低可測值一般小于 6.8 pg/mL。zui低可測值是根據(jù) 20 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到的相對應(yīng)濃度。
2. 校正：此 ELISA 試劑盒經(jīng)由 CHO 細(xì)胞表達(dá)的高純度重組小鼠 TGF-beta 1 蛋白校正。
3. 線性：6 個(gè)不同的樣本中摻入高濃度的小鼠 TGF-beta 1，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。
四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）
2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、實(shí)驗(yàn)流程圖

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）Beta 1、2 和 3（TGF-beta 1，TGF-beta 2 和 TGF-beta 3）是高度多效性細(xì)胞因子，幾乎所有細(xì)胞類型都可以分泌。TGF-beta 分子被建議用作調(diào)節(jié)免疫功能，增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程的細(xì)胞開關(guān)。這些基因在小鼠中的靶向缺失表明每種TGF-beta 亞型均具有某些非冗余功能：TGF-beta 1 參與造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化；TGF-beta 2 影響心臟，肺，顱面，肢體，眼睛，耳朵和泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育；TGF-beta 3 會(huì)影響腭器官發(fā)育形成和肺部發(fā)育。TGF-beta 5 的全部體外生物學(xué)活性目前仍尚未被wan全探索。但是， 在抑制性生物測定中，已發(fā)現(xiàn) TGF-beta 1，TGF-beta 2，TGF-beta 3 和 TGF-beta 5 在很大程度上可互換，并且預(yù)計(jì) TGF-beta 5 將顯示出一系列相似的活性其他 TGF-beta 家族成員。迄今為止，僅在非洲爪蟾中證明了 TGF-beta 5 的產(chǎn)生。   TGF-beta 配體最初被合成為經(jīng)歷蛋白水解切割的前體蛋白。成熟的區(qū)段通過由特征性的“半胱suan酸結(jié)"組成的富含二硫鍵的核形成活性配體二聚體。 TGF-beta 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)始于與附件受體 beta 聚糖（也稱為 TGF-beta RIII）和 II 型絲氨suan/蘇氨suan激酶受體（稱為 TGF-beta RII）的復(fù)合物結(jié)合。然后，該受體磷酸化并激活 I 型絲氨suan/蘇氨suan激酶受體，即 ALK-1 或 TGF-beta RI（也稱為 ALK-5）。激活的 I 型受體磷酸化并激活調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的 Smad 蛋白。使用不依賴 Smad 的其他信號通路可以在不同情況下觀察到對 TGF-beta 的不同反應(yīng)。

Mouse

1、僅供科研使用，不可用于體外診斷；
2、請?jiān)谠噭┖杏行趦?nèi)使用；
3、不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用；
4、樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基；
5、檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實(shí)驗(yàn)人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時(shí)間或溫度、試劑盒的儲存等。
6、試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時(shí)請做好眼睛、手、面部及衣服的防護(hù)。