細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒

        外泌體是由細(xì)胞分泌的包含 RNA 和蛋白質(zhì)的小囊泡（30-150 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等體液中大量存在。外泌體被認(rèn)為具有細(xì)胞間信使的功能，在特定細(xì)胞之間傳遞它們的效應(yīng)物或信號(hào)分子；然而其構(gòu)造、效應(yīng)物組成以及所參與的生物學(xué)通路目前尚不明晰。
        外泌體的生物學(xué)功能研究中需要分離完整的外泌體顆粒，而傳統(tǒng)超速離心方法步驟繁瑣、硬件要求高、操作難度大。本外泌體快速提取試劑盒，組分經(jīng)過優(yōu)化處理，適用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體提取，并搭配純化過濾裝置，可快速高效地獲得高純度外泌體顆粒，可用于電鏡分析、NTA 粒徑分析、核酸分析、蛋白分析、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。
產(chǎn)品組成：

* Nuclease-free, Sterile

自備材料：
高速離心機(jī)，渦旋振蕩器，50 mL 離心管，1.5 mL 離 心管，1×PBS 緩沖液（無菌）。
一、樣品預(yù)處理：

1、取樣：如果是凍存樣品，從冰箱取出后于 25℃水浴中進(jìn)行解凍，將wan全融化后的樣品置于冰上；如果是新鮮樣品，收集樣品后置于冰上；

2、樣品初始用量：單次提取時(shí)的樣品量建議細(xì)胞培養(yǎng)上清 液不低于 20 mL；
3、 離心去細(xì)胞碎片：將樣品轉(zhuǎn)移至離心管中，于 4℃以 3,000 ×g（~5,200 rpm**）離心 10 min，去除樣品 中的細(xì)胞碎片（注：若沉淀較多，可 3,000 ×g，10 min 離心多次至無明顯沉淀，每次取離心上清液）；
**為約10cm有效離心半徑的大離心機(jī)換算(≥15mL離心管），下同。
4、 離心去雜質(zhì)碎片：將離心上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中， 于 4℃以 10,000 ×g（~9,500 rpm**）離心 10 min， 去除樣品中的雜質(zhì)碎片；
5、 上清液轉(zhuǎn)移：去除雜質(zhì)碎片的上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。

二、提取外泌體：
 1、上清液預(yù)處理：在去除雜質(zhì)的離心上清液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 試劑），具體的加入劑量如下：（其他劑量請(qǐng)根據(jù)表中的試劑用量等比例換算）  

2、溶液混合：加入 ECS 試劑后將離心管蓋緊，通過渦旋  振蕩器混勻 1 min，再放置于 4℃靜置8   h 以上（注： 增加靜置時(shí)間可提高外泌體得率，但不可超過 24 h）；
3、沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于 4℃以 10,000 ×g（~9,500 rpm**）離心 60 min，棄上清，沉淀中 富含外泌體顆粒（注：盡可能吸盡上清液）；
4、再次離心：將含有沉淀的離心管再次于 4℃以  10,000 ×g（~9,500 rpm**）離心 2 min，棄上清（注：盡可 能吸盡上清液）；
5、外泌體重懸：取合適量的 1×PBS 均勻吹打離心沉淀物 ， 待其溶解后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 離心管中（建    議每 20 mL 細(xì)胞培養(yǎng)上清用 200 μL 左右 1×PBS 重懸）；
6、收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的 1.5 mL 離心管于 4℃  以 12,000 ×g（~12,400 rpm*）離心 2 min，保留上  清液，其中富含外泌體顆粒（注：若沉淀較多，可 12,000  ×g，2 min 離心多次至無明顯沉淀，每次取上清液）。
*為約7cm有效離心半徑的小離心機(jī)換算(≤2mL離心管），下同。

三、純化外泌體：
1、純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃以 3,000  ×g（~6,200 rpm*）離心 10 min，離心后收集 EPF  柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒（注： EPF 柱不可重復(fù)使用）；
2、外泌體的保存：純化后的外泌體以合適體積進(jìn)行分裝凍 存于-80℃低溫冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。