外泌體純化試劑盒(SEC)

需自備試劑：
1×PBS，使用0.22 um 濾膜過濾后再使用或者采購已過膜的PBS（使用前需平衡到室溫）。

一、樣本預(yù)處理：
細(xì)胞上清：
（1）收集細(xì)胞上清 10-50 mL（收集時細(xì)胞培養(yǎng)密度不低于 1×10 6 cfu/mL）；
（2）細(xì)胞上清離心（3000 g，10 min），保留上清；
（3）上清液使用 0.22 um 濾膜過濾；
（4）過濾后用 100 kDa 超濾管進(jìn)行濃縮，濃縮體積比為 1 : 20，收集濃縮液備用。
尿液：
（1）采集中段晨尿約 10-50 mL，離心（3000 g，10 min），保留上清；
（2）上清液使用 0.22 um 濾膜過濾；
（3）過濾后用 100 kDa 超濾管濃縮，濃縮體積比為 1：20，收集濃縮液備用。
二、外泌體分離：
1、試劑準(zhǔn)備：
保存液 (5×)和清洗液 (5×) 均需要用去離子水稀釋到 1×，所用試劑需用 0.22 um 濾膜過濾后再使用。
2、柱平衡：
（1）從冰箱取出 SEC 純化柱，將其垂直固定（需自備固定裝置）；
（2）置于室溫下放置 30 min；
（3）SEC 純化柱下方放置一個空燒杯；
（4）打開頂部柱塞和底蓋，將管中保存液排空至底部出口無液體流出，向柱中加入15mL PBS，可分次加，讓液體全部流出，再上樣。
3、樣品上樣：
（1）取 8 個 EP 管，依次標(biāo)記為 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8；
（2）將 1 mL 樣品從 SEC 純化柱頂部沿壁加入，樣品wan全進(jìn)入填料并且底部出口無液體流出后，加入 0.5 mL 1×PBS，使用 EP 管 1 收集流出液，收集體積為 0.5 mL；
（3）待上一個 0.5 mL 平衡液全部進(jìn)入排阻柱內(nèi)后，再添加 0.5 mL 的PBS，使用 EP 管 2 收集流出液，收集體積為 0.5 mL；
注意：使用時應(yīng)盡量保證柱內(nèi)有液體，以確保填料能夠被充分潤濕。
（4）重復(fù)（3）操作 6 次，總共收集 8 管洗脫液。
注意：樣品最小體積不應(yīng)小于 1 mL；樣品不足 1 mL 時，用 1×PBS稀釋到 1 mL，混勻后再上樣。
4、外泌體收集：
（1）若想獲得高回收率外泌體: 只保留3， 4，5，6，7的餾分，共計 2.5 mL；若不區(qū)分餾分，在第 2個 0.5 mL 1×PBS全部進(jìn)入排阻柱內(nèi)后，直接加入 2.5mL PBS，洗脫至一個收集管中。
（2）若想獲得高純度外泌體: 將第4， 5，6的餾分合并，共計 1.5 mL。
注意： 如需濃縮外泌體洗脫液，可使用 100 kDa 超濾管，4000 g 離心濃縮到目的體積即可。
5、SEC 純化柱的清洗與儲存：
收集結(jié)束后，加10 mL 清洗液，接著用1×PBS 沖洗15 mL，再用1×保存液沖洗10 mL。將底蓋關(guān)閉，用1×保存液填滿SEC 純化柱，用柱塞封閉頂部端口并檢查無液體流出后，4 ℃保存。
注意：1. 該 SEC 純化柱可重復(fù)使用 10 次。 2. 使用結(jié)束后需要用封口膜將柱上端封死，避免保存液揮發(fā)。