Balb/C小鼠正常小腸類器官培養(yǎng)基

1、原代 
（1）取材后的Balb/C小鼠正常小腸組織須在2-8°C清洗，準備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預冷的Balb/C小鼠正常小腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液#abs9731備用（添加雙抗和慶da霉素）。
（2）將組織放入培養(yǎng)皿中，利用Balb/C小鼠正常小腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次后，去除雜質，利用眼科剪或手術dao將Balb/C小鼠小腸組織腸粘膜去除，利用眼科剪或手術dao將組織jian切成體積約為 10-30mm3的組織塊。
（3）組織用Balb/C小鼠正常小腸組織原代組織消化ye#abs9644消化，4℃震蕩消化20-25min或靜置消化40-50min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。
（4）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的隱窩，加入三倍體積Balb/C小鼠正常小腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液終止消化。
（5）使用100um孔徑的篩網進行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加Balb/C小鼠正常小腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液重新重懸離心。
（6）基質膠計算：第5步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠#abs9495重懸鋪板。
（7）24孔細胞培養(yǎng)板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。
（8）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加Balb/C小鼠正常小腸類器官培養(yǎng)基（恢復室溫）進行培養(yǎng)。
2、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液#abs9730放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）a：類器官數量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清，添加適量Balb/C小鼠正常小腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。
         b：類器官數量較多或體積較大時：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液#abs9520消化2-3min，添加Balb/C小鼠正常小腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量Balb/C小鼠正常小腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質膠重懸，每孔25ul基質膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ulBalb/C小鼠正常小腸類器官培養(yǎng)基。
3、類器官凍存
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清，添加適量Balb/C小鼠正常小腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液再次重懸，300g離心5min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積1.4ml。
（5）做好標記信息，進行程序降溫后，移入液氮長期保存。
4、類器官復蘇
（1）取10mlBalb/C小鼠正常小腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內wan全融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量Balb/C小鼠正常小腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質膠重懸，每孔25ul基質膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500ulBalb/C小鼠正常小腸類器官培養(yǎng)基。

4°C保存，有效期3個月；-20°C保存，有效期1年。

Mouse(balb/C) Small Intestine Organoid Culture