人正常腸類器官培養(yǎng)基

人正常腸類器官基礎培養(yǎng)基可應用于人正常腸來源類器官的常規(guī)培養(yǎng)傳代，能夠保持其傳代后的生長活力，類器官培養(yǎng)過程中，不用添加任何其他蛋白因子。

1、原代 
（1）取材后的組織放在預冷的（2-8°C）組織保存液的取樣瓶中，快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和細胞分離，拍照并登記信息。
（2）準備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預冷的人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液#abs9731備用。
（3）取樣瓶消毒，將組織放入培養(yǎng)皿中，利用人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次后，利用眼科jian或手術dao將組織jian切成體積約為 1-3mm3的組織塊。
（4）組織用消化液#abs9749消化，4℃震蕩消化10-20min，（消化過程中隨時觀察消化情況）。
（5）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后，加入三倍體積人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液終止消化。
（6）使用100um孔徑的篩網(wǎng)進行過濾，將濾液收集后，于300g富集離心5min后移去上清，添加人正常腸類器官組織原代培養(yǎng)緩沖液重新重懸離心。
（7）基質膠計算：第6步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠#abs9495 重懸鋪板。
（8）24孔細胞培養(yǎng)板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（4℃下操作）。
（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加人正常腸類器官培養(yǎng)基（恢復室溫）進行培養(yǎng)。
2、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液#abs9730放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）a：類器官數(shù)量不足或體積較小時： 離心5min棄去上清，添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。
         b：類器官數(shù)量較多或體積較大時：離心5min棄去上清，添加適量類器官傳代消化液#abs9520 消化2-3min，添加人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液終止消化，離心5min棄去混合液，添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體進行第4步。
（4）類器官收集后，添加基質膠重懸，每孔25ul基質膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500ul人正常腸類器官培養(yǎng)基。
3、類器官凍存
（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液放置2min。
（2）移液槍輕柔吹打基質膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置10min。（每6-8孔為一組）
（3）離心5min棄去上清，添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液再次重懸，300g離心5min棄去液體。
（4）添加適量類器官凍存液#abs9519，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存1管，每管體積1.4ml。
（5）做好標記信息，進行程序降溫后，移入液氮長期保存。
4、類器官復蘇
（1）取10ml人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的類器官細胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內wan全融解。
（4）將溶解后的類器官細胞快速轉移至15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打6-8次，300g 離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細胞沉淀。添加適量人正常腸類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質膠重懸，每孔25ul基質膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500ul人正常腸類器官培養(yǎng)基。

4°C保存，有效期3個月；-20°C保存，有效期1年。