實驗室WB常見問題指南之抗體常見問題

針對抗體常見問題

Q：做細胞信號傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

A：對二抗有無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。

Q：免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

A：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和 Western，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區(qū)間（限于單抗）。而且一般的說明書上都會寫出用于何種實驗類型，參考說明書即可。

Q：Western Blot 中抗體能重復(fù)利用嗎？

A：抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

濾紙、膠和膜的問題

Q：NC膜\ PVDF膜\ 尼龍膜有何區(qū)別？

A：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用zui廣的一種固相支持物，價格*；PVDF膜介于二者之間。

• 就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm²，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達 80－100μg/cm²，對于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm²。
• 就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
• 就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。
• 就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。

Q：做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

A：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。

Q：跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？

A：有可能是膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了。也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。

Q: 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

A：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE， 170kd 用7%SDS－PAGE,分開轉(zhuǎn)較好。

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