實驗室WB常見問題指南之Marker，染色及內(nèi)參等相關(guān)問題

Marker，染色及內(nèi)參等相關(guān)問題

Q：用的是預(yù)染marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。

A：一般來說，是小分子量Marker跑走了，可以增加膠濃度或減少電泳時間。梯度膠也是不錯的選擇。（梯度凝膠愛必信就可提供呦）

Q：Western Blot哪種染色好？

A：（1）陰離子染料是zui常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)到1.5μg，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S 和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。

   （2）膠體金，靈敏度高，檢測范圍可到pg級，但染色比穩(wěn)定。

   （3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。

Q：是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？

A：對于發(fā)表文章的實驗一定要加內(nèi)參，實驗嚴(yán)謹(jǐn)。

Q：用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎？

A：分析一般的結(jié)果沒問題。

Q: 核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？

A：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。

Q：轉(zhuǎn)膜時采用電流是否比電壓準(zhǔn)確，是否根據(jù)0.8mA/cm²，一般1小時左右？

A：不是的， 半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時間，一般蛋白越大，轉(zhuǎn)膜所需時間就越長。

Q：封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做，或者要在4度下?

A：均可在室溫進(jìn)行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個小時，然后4度過夜。

Q： PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？

A：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合 （注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。

Q：酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

A：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般建議添加。

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