活細(xì)胞到固定細(xì)胞！一文掌握細(xì)胞染色全方法

細(xì)胞染色是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中一項(xiàng)非?；A(chǔ)且重要的技術(shù)，用于在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分以及生理狀態(tài)。細(xì)胞染色方法種類繁多，可以根據(jù)染色原理、染色對(duì)象和細(xì)胞狀態(tài)（活細(xì)胞/死細(xì)胞）等進(jìn)行分類。以下是主要的細(xì)胞染色方法分類和介紹：

一、 根據(jù)細(xì)胞活性分類

1、活細(xì)胞染色

用于觀察活細(xì)胞的生理狀態(tài)、細(xì)胞器、胞內(nèi)離子濃度等，通常要求染料毒性小，不影響或極小影響細(xì)胞正常生命活動(dòng)。

1）臺(tái)盼藍(lán)染色： 較經(jīng)典的死細(xì)胞鑒別染色。臺(tái)盼藍(lán)不能穿透活細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可以進(jìn)入死細(xì)胞，使其染成藍(lán)色。常用于細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)計(jì)算細(xì)胞存活率。

2）熒光染料染色：

鈣離子指示劑（如 Fluo-3, Fura-2）： 與胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后產(chǎn)生熒光，用于檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。線粒體染料（如 MitoTracker, JC-1）： 特異性標(biāo)記活細(xì)胞中的線粒體，JC-1還可用于檢測(cè)線粒體膜電位。

溶酶體染料（如 LysoTracker）： 特異性標(biāo)記酸性細(xì)胞器如溶酶體。

細(xì)胞膜染料（如 DiI, DiO）： 親脂性染料，可嵌入細(xì)胞膜磷脂雙分子層中，用于細(xì)胞膜標(biāo)記和示蹤。

3）活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染色試劑盒：

a. 常用組合如 鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）/ 碘化丙啶（PI）。

鈣黃綠素-AM本身不發(fā)熒光，進(jìn)入活細(xì)胞后被酯酶水解產(chǎn)生綠色熒光。

碘化丙啶（PI）不能進(jìn)入活細(xì)胞，但可進(jìn)入死細(xì)胞并與DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。

b. 可在熒光顯微鏡下同時(shí)區(qū)分活細(xì)胞（綠色）和死細(xì)胞（紅色）。

2、固定細(xì)胞染色

細(xì)胞先經(jīng)過固定劑（如多聚甲醛、甲醇、乙醇）處理，使其死亡并保持原有形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時(shí)增加細(xì)胞膜的通透性，便于染料進(jìn)入。

幾乎所有下面的化學(xué)染色和免疫染色都需要先固定細(xì)胞。

二、 根據(jù)染色原理和目的分類

1、常規(guī)化學(xué)染色（主要基于染料與細(xì)胞成分的化學(xué)親和力）

吉姆薩染色： 常用于血液涂片，可區(qū)分白細(xì)胞的各種類型（嗜中性、嗜酸性、嗜堿性粒細(xì)胞等）和瘧原蟲等寄生蟲。

瑞氏染色： 與吉姆薩染色類似，廣泛用于血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

蘇木精-伊紅染色： 生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中很經(jīng)典、很常用的染色方法。

1）蘇木精：堿性染料，將細(xì)胞核內(nèi)的核酸染成藍(lán)紫色。

2）伊紅：酸性染料，將細(xì)胞質(zhì)和胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)染成粉紅色。

3）兩者結(jié)合可清晰顯示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

結(jié)晶紫染色： 常用于革蘭氏染色（細(xì)菌分類）和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如克隆形成試驗(yàn)）。

2、熒光染色

使用熒光染料或熒光蛋白，在特定波長(zhǎng)激光激發(fā)下發(fā)出熒光，具有靈敏度高、可進(jìn)行多色標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)。

1）DNA/核染色：

DAPI： 與DNA雙螺旋小溝結(jié)合，發(fā)藍(lán)色熒光。很常用的細(xì)胞核染料。

Hoechst 33342/33258： 與DAPI類似，發(fā)藍(lán)色熒光，Hoechst 33342可用于活細(xì)胞。

碘化丙啶： 與DNA結(jié)合發(fā)紅色熒光，但不能透過活細(xì)胞膜，故用于死細(xì)胞核染色。

2）細(xì)胞骨架染色：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）： 特異性與細(xì)胞內(nèi)的微絲（F-actin） 緊密結(jié)合，常用熒光標(biāo)記物（如FITC、TRITC）標(biāo)記，顯示細(xì)胞形態(tài)和骨架結(jié)構(gòu)。

3）細(xì)胞器特異性染料：

ER-Tracker： 標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

MitoTracker： 標(biāo)記線粒體。

LysoTracker： 標(biāo)記溶酶體。

3、免疫染色

利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)特定靶蛋白進(jìn)行定位和可視化。是研究蛋白質(zhì)表達(dá)和定位的金標(biāo)準(zhǔn)方法。

1）免疫熒光：

用熒光素（如FITC, TRITC, Alexa Fluor系列）標(biāo)記的抗體與細(xì)胞內(nèi)特定抗原結(jié)合。

可在熒光顯微鏡下直接觀察目標(biāo)蛋白的位置和表達(dá)量。

通常與DAPI等核染料共染，以確定位置。

2）免疫組織化學(xué)/免疫細(xì)胞化學(xué)：

原理與免疫熒光類似，但抗體上標(biāo)記的是酶（如HRP辣根過氧化物酶）。

加入底物（如DAB）后，酶催化底物產(chǎn)生不溶性的有色沉淀，從而在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到目標(biāo)蛋白的棕褐色信號(hào)。

4、原位雜交

用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。

熒光原位雜交： 用熒光標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)的特定基因序列或mRNA結(jié)合，從而對(duì)基因進(jìn)行定位或檢測(cè)mRNA的表達(dá)。常用于基因擴(kuò)增、染色體異常等研究。

5、基因編碼的熒光蛋白

嚴(yán)格來說這不是染色，而是遺傳學(xué)標(biāo)記方法。

將編碼綠色熒光蛋白或其他顏色熒光蛋白的基因與目的基因融合，轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中并表達(dá)。

細(xì)胞自身會(huì)合成熒光蛋白，從而在活體狀態(tài)下實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)、定位和遷移。例如：GFP（綠色熒光蛋白）。

總結(jié)與選擇指南

如何選擇染色方法？

1、目的決定方法：

看細(xì)胞形態(tài) → HE染色、吉姆薩染色。

看特定蛋白在哪里 → 免疫熒光。

看細(xì)胞是否存活 → 臺(tái)盼藍(lán)、Calcein-AM/PI。

看細(xì)胞核 → DAPI。

看線粒體 → MitoTracker。

在活細(xì)胞中動(dòng)態(tài)觀察蛋白 → 基因編碼熒光蛋白。

2、考慮細(xì)胞狀態(tài)： 活細(xì)胞還是固定細(xì)胞？

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