免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒

 注：  Lysis buffer 使用前，立刻加入 1 mM PMSF（終濃度）（推薦購買abs9146，自行配制）。

一、制備細胞裂解物：
1、吸干培養(yǎng)基。添加含有調節(jié)分子的新鮮培養(yǎng)基，使其在預定的時間內對細胞進行處理。
2、收集細胞，去除培養(yǎng)基后用冰預冷的 1 X PBS 洗滌細胞一次。
3、去除 PBS 并在每個細胞板上（10 cm）加入 0.5 mL 冰預冷的 Lysis buffer，并在冰上孵育至少5分鐘。
4、從板上刮下細胞，把提取物轉移至微量離心管。置于冰上。
5、在冰上進行 3 次超聲破碎，每次 5 秒。（PS：超聲條件需根據液體量、探頭直徑以及最大功率調整。以200W功率超聲儀器為例，用 3 mm 的探頭。我們一般推薦使用 35%-40% 的最大功率進行 3 次超聲脈沖， 每次超聲之間停頓 10 秒。）
6、在 4 °C，在 14,000 x g 條件下，微量離心10分鐘，將上清轉移到新管中。上清液即為細胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 -80 °C。
注：細胞裂解物制備好之后，可先進行蛋白免疫印跡法檢測，以此來確定細胞裂解物里存在目標蛋白。

二、免疫沉淀法：
1、細胞裂解物預清除（可選步驟）
（1）向 500 μL（含總蛋白 200 -1000 ug）細胞裂解物中添加 5 μL Protein A 和 5 μL Protein G。
（2）在 4 °C 下，旋轉孵育 30 - 60 分鐘。
（3）4°C 條件下 12000g 離心1分鐘，保留上清，待用。
2、抗原抗體結合
（1）在新的離心管內加入 500 μL（含總蛋白 200 – 1000 ug）細胞裂解物（可以是預清洗后的細胞裂解物）。
（2）加入目標蛋白的單克隆/多克隆抗體（1 – 5 μg）。
（3）同時采用非特異免疫的同源抗體作為對照。
（4）在 4 °C 輕柔混合過夜。
3、免疫復合物沉淀
（1）抗體孵育過夜后，加入 5 μL Protein A 和 5 μL Protein G。
（2）在 4 °C 溫和地混勻1-3小時或過夜。
（3）12,000 g 離心1 分鐘，保留沉淀。
（4）使用 0.5 mL 1*Wash buffer 清洗沉淀，12,000 g 離心1分鐘，保留沉淀。
（5）重復第4步，共計清洗3次。
注：清洗，去上清的時候需要注意避免吸走填料
4、用蛋白免疫印跡法進行分析
（1）在 20 - 40 μl 1*SDS 樣品緩沖液中重懸沉淀物，渦旋振蕩，然后再微量離心30秒，以使附著管壁的珠子和液體到管底。
（2）將樣品加熱至 95 - 100 °C 并持續(xù)2 - 5分鐘，然后在 14,000 g下瞬時離心1分鐘，取上清液。
（3）將樣品（15 – 30 μL）上樣到 SDS-PAGE 凝膠上。
（4）用蛋白質印跡法分析樣品。

本試劑盒4℃保存，1年有效。
注意：Protein A和Protein G的基質為20%乙醇，較易揮發(fā)，使用時應注意密封，如出現揮發(fā)情況，可使用20%乙醇重懸。