Human EGF ELISA Kit

人表皮生長因子ELISA試劑盒,beta-urogastrone, EGF, epidermal growth factor (beta-urogastrone), epidermal growth factor, HOMG4, pro-epidermal growth factor, URG, Urogastrone

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗人EGF抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的EGF與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

3.9pg/mL-250pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標(biāo)儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機(jī)
5. 500mL量筒

一、實驗前準(zhǔn)備
1. 樣品搜集及儲存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進(jìn)行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當(dāng)次試驗所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為250pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點（250pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點（0pg/mL）。



二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪茫谖埮母伤袣埩粢后w；
6. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會受影響；
13. 計算結(jié)果：將每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng)OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的Human EGF， 測定其回收率。 回收率范圍在96-103%，平均回收率在99%。 
2. 靈敏度：Human EGF的zui低可測劑量（MDD）一般在0.089-0.740pg/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標(biāo)準(zhǔn)曲線零點吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計算得到的相對應(yīng)濃度。
3. 校正：此 ELISA 試劑盒經(jīng)sf-21昆蟲細(xì)胞表達(dá)的高純度重組Human EGF蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的Human EGF，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組Human EGF蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成50ng/mL的濃度來檢測與Human EGF的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組Human EGF對照品中，來檢測對Human EGF的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。與重組Human Pro-EGF交叉反應(yīng)約2.3%。

四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

EGF（表皮生長因子，又稱Urogastrone）前體是生長因子EGF家族的Group I成員，分子量為185kDa。Group I成員是結(jié)合并活化表皮生長因子受體（EGFR）的分子。EGF家族成員被合成為I型跨膜（TM）蛋白，且由蛋白水解生成可溶形式。人表皮生長因子（EGF）是一個長為1185個氨基酸前體分子形式的一個片段，包含1010個氨基酸細(xì)胞外區(qū)域、21個氨基酸TM區(qū)域和153個氨基酸胞質(zhì)域。這個前體的胞外域（ECD）有三個主要的結(jié)構(gòu)模塊。其中包括9個BLDLR重復(fù)、1個血管性血友病因子A區(qū)域和9個類EGF重復(fù)，并在近膜區(qū)包含了成熟EGF分子的53個氨基酸的結(jié)構(gòu)（為前體形式的第971位至1023位氨基酸）。這個跨膜185kDa的亞型（氨基酸21-1023），存在于大多數(shù)體液中。這個過程同時產(chǎn)生了大量40-100kDa的蛋白片段，可能為蛋白水解降解產(chǎn)物。6kDa成熟EGF亞型的產(chǎn)生過程尚不清楚。它可能源自細(xì)胞內(nèi)部，也可能源于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞表面的膜結(jié)合絲氨suan酶水解可溶性的160kDa前體或這個前體水解以后生產(chǎn)的70kDa的分子亞型而來。
值得注意的是，成熟形式的EGF、185kDa跨膜蛋白、已被水解但尚未加工的循環(huán)型分子和160kDa前體分子都具有生物學(xué)活性。而這些生物學(xué)活性主要是因為有EGF肽段嵌入在這些前體分子中。其它類型EGF的修飾都不具備結(jié)合EGF受體的活性。編碼EGF的基因在表達(dá)EGF蛋白過程中存在4種可能的剪切體，但都不影響成熟EGF的序列。其中兩種剪切體發(fā)生在胞外區(qū)序列，分別刪除了第913位至953位的氨基酸和第314至355位的氨基酸。另外兩種剪切體則涉及EGF的胞內(nèi)區(qū)域，分別以12個氨基酸替換了第1125位至1207位的氨基酸和以17個氨基酸替換了第1136-1207位的氨基酸。成熟的人EGF與小鼠、大鼠和豬的EGF的同源性分別是70%、70%和85%。已知表達(dá)EGF的細(xì)胞包括血小板、大腦神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小腦浦肯野細(xì)胞、布魯納細(xì)胞（十二指腸）和頜下腺細(xì)胞、不著色的纖毛上皮和垂體前葉細(xì)胞。EGF有許多不同的生理作用。目前廣泛認(rèn)可的EGF功能主要基于EGF受體-配體的結(jié)合而實現(xiàn)。而EGF受體也能和其它EGF家族的蛋白結(jié)合，進(jìn)而形成異源多聚體并與其它EGF受體家族成員二聚化，或者和其它跨膜蛋白如PDGFR和HGF受體產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。在任何一種情況下，EGF都可以對胎兒和成人組織產(chǎn)生作用。在胎兒，EGF影響雙陰性-雙陽性階段的胸腺細(xì)胞生長和分化。在神經(jīng)元形成過程中，EGF似乎也可以刺激神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元的生成并促進(jìn)其上皮化。最后，它能抑制脂肪細(xì)胞的成熟，從而增加前脂肪細(xì)胞數(shù)量。在成人，EGF可以在乳腺的乳生成過程中發(fā)揮作用，也可使纖維細(xì)胞有絲分裂，ECM離解和遷移，廣泛地影響生長因子相關(guān)的各種作用。
EGF受體即表皮生長因子受體（也稱為HER1和ErbB1），其激活機(jī)制尚不明確。目前的研究認(rèn)為每一個EGF分子和一個EGF受體分子有兩個結(jié)合位點，這會迫使受體產(chǎn)生構(gòu)象變化，而和第二個EGF-EGFR復(fù)合物結(jié)合。這種二聚體即具有實際功能的EGF受體。ErbB2也可以和EGF受體形成異源二聚體，但不能和EGF結(jié)合。這可能是因為ErbB2天然以二聚體的形式存在，掩蓋了其配體結(jié)合的位點，而使配體無法與其結(jié)合。因此，它需要結(jié)合一個已經(jīng)激活的EGF-EGFR復(fù)合體才能形成一個功能性的EGF受體。而由于內(nèi)在的靜電斥力作用，ErbB2自身無法形成同源二聚體。EGF也只有在高濃度的環(huán)境下也能和ErbB3：ErbB2形成異源多聚體。這個過程的重要性，目前仍是未知的。EGFR的選擇性剪切亞型存在于腫瘤細(xì)胞中，并可能參與腫瘤發(fā)生或使細(xì)胞對EGF受體抑制劑敏感。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲存。