Human IL-2 ELISA Kit

aldesleukin, IL2, IL-2, IL-2lymphokine, interleukin 2, interleukin-2, involved in regulation of T-cell clonal expansion, T cell growth factor, T-cell growth factor, TCGF,人白介素2Elisa試劑盒

Human IL-2 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗人IL-2抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-2與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標(biāo)儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準(zhǔn)備
1. 樣品收集及儲存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色劑：按每孔100uL，計算當(dāng)次試驗所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點（1000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會受影響；
13. 計算結(jié)果：將每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng)OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的人IL-2，測定其回收率?；厥章史秶?02-104%，平均回收率在103%。
2. 靈敏度：人IL-2的zui低可測劑量（MDD）一般小于3.24pg/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標(biāo)準(zhǔn)曲線零點吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計算得到的相對應(yīng)濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的高純度重組人IL-2蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的人IL-2，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。


5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組人IL-2蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測與人IL-2的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組人IL-2對照品中，來檢測對人IL-2的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。




四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

人白細(xì)胞介素2（IL-2），又稱為T細(xì)胞生長因子（TCGF），是一個分子量為15-18kDa的具有不同糖基化的α螺旋多肽，屬于常見的γ鏈（γc）細(xì)胞因子家族成員。它以單體存在，半衰期很短（<30min）。人IL-2的前體有153個氨基酸，其中包含一個20個氨基酸的信號序列，和一個133個氨基酸的成熟多肽。IL-2成熟蛋白包含一個在3位蘇氨suan可O型糖基化的位點和三個半胱氨suan，其中的兩個半胱氨suan所形成的鏈內(nèi)二硫鍵是IL-2活性所bi不可少的。成熟的人IL-2氨基酸序列與犬、大鼠、貓和獼猴的IL-2同源性分別為73%、66%、78%和97%。雖然人IL-2與高度多態(tài)的小鼠IL-2僅有60%的氨基酸同源性，但人IL-2對小鼠細(xì)胞也具有生物活性。據(jù)報道分泌IL-2的細(xì)胞包括γδT細(xì)胞、活化的常規(guī)CD4+和CD8+T細(xì)胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞。
IL-2受體（IL-2R）由三個亞基構(gòu)成，即一個55kDa的CD25/IL-2Rα鏈、一個70kDa的CD122/IL-2Rβ鏈，以及一個65kDa的CD132/γc鏈。IL-2先與CD25結(jié)合，形成的二亞基復(fù)合物再招募CD122和CD132，形成具有四個亞基的信號復(fù)合物。除了能與IL-2形成復(fù)合物，CD122/IL-2Rβ也可同IL-15形成四亞基信號復(fù)合物。CD132/?c亦可成為IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21信號的受體。
體外研究表明，IL-2在T細(xì)胞活化和擴增中起重要作用。在體內(nèi)，IL-2是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）發(fā)育、維持和功能的關(guān)鍵，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可為自身免疫性疾病提供保護。此外，IL-2也可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞販運基因的表達(dá)和Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而促進其靶器官自身免疫性炎癥。在CD8+T細(xì)胞亞群中，IL-2是獲得最佳一級反應(yīng)和分化到終端效應(yīng)細(xì)胞的必要關(guān)鍵。IL-2也促進了CD8+T細(xì)胞的發(fā)育和激活成為記憶細(xì)胞。

Human

未開封試劑盒，2-8℃儲存。

1. 請在試劑盒有效期內(nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。