Human TNF-α ELISA Kit

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Human TNF-α ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗人TNF-α抗體預(yù)包被在高 親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和生wu素化的檢測(cè)抗體，經(jīng)過孵育， 樣本中存在的TNF-α與固相抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的 物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)（參考校正波長(zhǎng)540nm或570nm） 測(cè)定吸光度值。

Human

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自備試驗(yàn)器材
1. 酶標(biāo)儀（可測(cè)量450nm檢測(cè)波長(zhǎng)的吸收值及540nm或570nm校正波長(zhǎng)的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)
5. 500mL量筒

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 樣品搜集及儲(chǔ)存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測(cè)樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)┦占獫{，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請(qǐng)將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測(cè)）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實(shí)際操作時(shí)可先計(jì)算使用量，再進(jìn)行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實(shí)際操作時(shí)可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計(jì)算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
③檢測(cè)抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計(jì)算所需體積。例：使用了10個(gè)孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測(cè)抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個(gè)孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。
⑤顯色劑：按每孔100uL，計(jì)算當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個(gè)稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)（1000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請(qǐng)立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí);
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會(huì)有助于得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請(qǐng)將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪茫谖埮母伤袣埩粢后w；
6. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL檢測(cè)抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí)；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會(huì)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請(qǐng)輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長(zhǎng)。如果沒有使用雙波長(zhǎng)校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響；
13. 計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對(duì)數(shù)與相應(yīng)OD值對(duì)數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗(yàn)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的人TNF-α，測(cè)定其回收率?；厥章史秶?8-102%，平均回收率在100%。
2. 靈敏度：人TNF-α的可測(cè)劑量（MDD）一般小于0.68pg/mL?？蓽y(cè)值是根據(jù)20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到的相對(duì)應(yīng)濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的高純度重組人TNF-α蛋白所校正。
4. 線性：4個(gè)不同的樣本中摻入高濃度的人TNF-α，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測(cè)范圍內(nèi)，測(cè)定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測(cè)天然及重組人TNF-α蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測(cè)與人TNF-α的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組人TNF-α對(duì)照品中，來檢測(cè)對(duì)人TNF-α的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。


四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽(yáng)性對(duì)照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）




五、實(shí)驗(yàn)流程圖

人TNF-α是一個(gè)26kDa的II型跨膜蛋白，由一個(gè)35個(gè)氨基酸（aa）胞內(nèi)域、一個(gè)21aa跨膜段和一個(gè)177aa的胞外域（ECD）組成。在ECD區(qū)，人TNF-α和獼猴有97%氨基酸序列同源性，與牛、犬、棉鼠、馬、貓、小鼠、豬、大鼠有71-92%的氨基酸序列同源性。它可以由多種不同細(xì)胞如免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。TNF-α能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的裂解，并與可溶性TNFRI結(jié)合，產(chǎn)生下游細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)到信號(hào)。TACE/ADAM17可引起含有TNF-α細(xì)胞膜的脫落從而釋放具有活性的TNF-α細(xì)胞因子，它是由TNF-α胞外可溶性結(jié)構(gòu)構(gòu)成的三聚體，分子量為55kDa。
TNF-α有兩個(gè)受體：TNFRI和TNFRII。TNFRI分子量為55-60kDa，表達(dá)廣泛；TNFRII分子量為78-80kDa，僅限于造血細(xì)胞表達(dá)。兩者都是以同源三聚體形式表達(dá)；TNF-α和TNFRI和TNFRII結(jié)合的親和力相似，可促進(jìn)NFκB的激活。然而，僅有TNFRI具有細(xì)胞死亡結(jié)構(gòu)域，能引發(fā)細(xì)胞凋亡。這兩種可溶性受體都被釋放到人的血清和尿液中，并能中和TNF-α的活性。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲(chǔ)存。

1. 請(qǐng)?jiān)谠噭┖杏行趦?nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號(hào)試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測(cè)；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基。
4. 檢測(cè)結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實(shí)驗(yàn)人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時(shí)間或溫度、試劑盒的儲(chǔ)存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時(shí)請(qǐng)做好眼鏡、手、面部及衣服的防護(hù)。