Human IL-23 ELISA Kit

IL-23 p19/IL-12 p40, IL23, IL-23, IL-23A, IL-23-A, IL-23p19, IL-23p19/IL-12p40, IL23P19P19, interleukin 23 p19 subunit, interleukin 23, alpha subunit p19, interleukin-23 subunit alpha, Interleukin-23 subunit p19, JKA3 induced upon T-cell activation, MGC79388, SGRF, SGRFIL-23 subunit alpha

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗人IL-23 抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-23與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在 450 nm 波長(參考校正波長 540nm 或 570nm) 測定吸光度值。

Human

雙抗夾心法

125.0 - 8,000 pg/mL

實驗所需自備試驗器材
酶標(biāo)儀（可測量 450nm 檢測波長的吸收值及 540nm 或 570nm 校正波長的吸收值） 
高精度加液器及一次性吸頭 
蒸餾水或去離子水 
洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機(jī) 
500mL 量筒 


（1）樣品收集及儲存：
細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×） 稀釋。 血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置 30 分鐘。離心 15 分鐘，轉(zhuǎn)速為 1000 g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。 血漿：使用 EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后 30 分鐘內(nèi)離心 15 分鐘，轉(zhuǎn)速為 1000 g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
（2）檢測前準(zhǔn)備工作：
使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測
1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10ml濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進(jìn)行配制。
1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3ml濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5min后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1ml的1×工作濃度的檢測抗體。
SA-HRP： SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100 uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1ml的1×工作濃度的檢測抗體。
顯色劑：按每孔100 uL，計算當(dāng)次試驗所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當(dāng)日使用。
標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為 8000pg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少 5 分鐘，其充分溶解。
每個稀釋管中加入 300 uL 稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(8000pg/mL)，稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點（0 pg/mL）。二、實驗操作步驟
（1）準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
（2）從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
（3）向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
（4）分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔 100 uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育 2 小時;
（5）將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液 300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作 3 次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體；
（6）在每個微孔內(nèi)加入 100 uL 檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育 2 小時；
（7）重復(fù)第 5步洗板操作；
（8）在每個微孔內(nèi)加入 100 uL SA-HRP，室溫孵育 20 分鐘。注意避光；
（9）重復(fù)第 5 步洗板操作；
（10）在每個微孔內(nèi)加入 100 uL 顯色液，室溫孵育 5-30 分鐘，注意避光；
（11）在每個微孔內(nèi)加入 50 uL 終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
（12）加入終止液后 30 分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量 450nm 的吸光度值，設(shè)定 540nm 或 570nm 作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會受影響；
（13）計算結(jié)果：將每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品 OD 值。使用計算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng) OD 值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本含量。
三、試劑盒參數(shù)
1.回收率
在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的人 IL-23 ， 測定其回收率。 回收率范圍在93.9-103.2%，平均回收率在99.8% 。 在人血清樣本中摻入不同水平的人 IL-23，測定其回收率?；厥章史秶?91.7-99.1%，平均回收率在 96.2%。
2.靈敏度
人IL-23 的zui低可測劑量（MDD） 一般小于 20.5pg/mL。 zui低可測值是根據(jù) 20 個標(biāo)準(zhǔn)曲線零點吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計算得到的相對應(yīng)濃度。
3.校正
此 ELISA 試劑盒經(jīng) Sf 21 表達(dá)的高純度重組人 IL-23 蛋白所校正。
4.線性
4 個不同的樣本中摻入高濃度的人 IL-23， 然后用稀釋劑（1×） 將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)， 測定其線性。

5.特異性
此 ELISA 法可檢測天然及重組人 IL-23蛋白。 將以下因子用稀釋劑（1×） 配制成 50 ng/mL 的濃度來檢測與人 IL-23的交叉反應(yīng)。 將 50 ng/mL 的干擾因子摻入中間范圍的重組人 IL-23對照品中， 來檢測對人EGF 的干擾。 沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。重組人 IL-12 Rβ1/Fc Chimera 及重組人 IL-23 R/Fc Chimera 沒有交叉反應(yīng)，但當(dāng)濃 度>3125pg/mL 時有干擾。

四、常見問題解析
1.白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2、花板（空白、陰性陽性對照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、總體步驟圖

白細(xì)胞介素 23 (IL-23) 是一種由 IL-23 te有的 p19 亞基和 IL-12 共享的 p40 亞基組成 的二硫化物連接的細(xì)胞因子。它是由活化的巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及和單核細(xì)胞來源的樹突 狀細(xì)胞產(chǎn)生，以應(yīng)對包括某些細(xì)菌和病毒和/或其組分等病原體的攻擊。功能性 IL-23 受體復(fù)合物包含兩個受體亞基，IL-12 受體 β1 亞基(IL-12Rβ1)和 IL-23-特異性的受體亞基(IL-23 R)。該受體復(fù)合物表達(dá)在小鼠 Th1、Th2細(xì)胞，骨髓樹突狀細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞和CD4+CD45Rb(low)記憶 T 細(xì)胞。 IL-23 免疫途徑誘導(dǎo)最早的中性粒細(xì)胞到感染灶的募集。 IL-23 亦加強(qiáng)了Th17 細(xì)胞的發(fā)展和保持。它促進(jìn)了Th17 介導(dǎo)的自身免疫和腫瘤進(jìn)展。在人類，IL-23 在包括牛皮癬、克羅恩病和多發(fā)性硬化在內(nèi)的幾種免疫功能失調(diào)疾病中表達(dá)上調(diào)。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲存。

（1）僅供科研使用，不可用于體外診斷；
（2）請在試劑盒有效期內(nèi)使用；
（3）不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用；
（4）樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基；
（5）檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時間或溫度、試劑盒的儲存等。
（6）試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護(hù)。