牛痘病毒加帽酶

簡要描述：牛痘病毒加帽酶，來源于攜帶牛痘病毒 MR的重組大腸桿菌菌株，由 D1R 和 D12L 兩個亞基組成，兼具三種酶活性（RNA 三磷酸酶活性、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和niao嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性）。

產(chǎn)品型號：abs60152
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
更新時間：2025-11-21
訪問量：2494

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Product Category

分子生物學

核酸提取/純化 qPCR系列 mRNA合成轉(zhuǎn)染產(chǎn)品分子克隆其它分子生物學試劑

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詳細介紹

品牌	absin	貨號	abs60152
規(guī)格	500U/2000U/10000U	供貨周期	現(xiàn)貨
主要用途	1、體內(nèi)或體外翻譯前 mRNA 的加帽； 2、mRNA 的 5'末端標記。	應用領(lǐng)域	化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥,綜合

產(chǎn)品描述

描述

牛痘病毒加帽mei，來源于攜帶牛痘病毒 MR的重組大腸桿菌菌株，由 D1R 和 D12L 兩個亞基組成，兼具三種酶活性（RNA 三磷酸酶活性、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和niao嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶活性）。牛痘病毒加帽mei是催化形成帽子結(jié)構(gòu)的有效酶，能特異性地將 7-甲基鳥苷酸帽子結(jié)構(gòu)(m7Gppp，Cap 0) 加至 RNA 的 5'端。帽子結(jié)構(gòu)(Cap 0)對真核生物 mRNA 的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和翻譯有著重要的作用。通過酶促反應給RNA 加帽是一種有效簡單的方法，能顯著改善用于體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和顯微注射的 RNA 的穩(wěn)定性和翻譯能力。
產(chǎn)品組分：

組分	不同規(guī)格各組分體積
組分	500U	2000U	10000U
牛痘病毒加帽mei（10 U/μL）	50 μL	200 μL	1 mL
10×加帽緩沖劑	100 μL	400 μL	2×1 mL

儲存緩沖液：
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% glycerol.
活性定義：
在 37℃條件下，1 h 內(nèi)將 10 pmol GTP wan全摻入到 80 nt 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所需的酶量定義為 1 個活性單位(U)。

來源

攜帶牛痘病毒MR的重組大腸桿菌

應用

1、體內(nèi)或體外翻譯前 mRNA 的加帽； 2、mRNA 的 5'末端標記。

純度

≥90%

使用方法

反應體系和條件：
1、加帽反應（反應體系 20 μL）
本實驗步驟適用于 10μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反應，可根據(jù)實驗需要放大：
（1）取 10 μg RNA 至 1.5 mL 離心管中，使用無核酸酶水稀釋至 15 μL；
（2）65℃加熱 5 min，然后取出冰浴 5 min 完成變性；
（3）根據(jù)下表配制加帽體系

組分	使用量
變性RNA（≤10 μg，長度≥100 nt）	15 μL
10×加帽緩沖劑*	2 μL
GTP （10 mM）	1 μL
SAM （2 mM）	1 μL
牛痘病毒加帽酶（10 U/μL）	1 μL

*10×加帽緩沖劑：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
（4）37℃孵育 30 min, RNA 加帽完成，可進行后續(xù)實驗。
2、5'末端標記反應（反應體系 20 μL）
本實驗步驟適用于 5'末端帶有三磷酸的RNA 標記，且可根據(jù)實驗需要放大，其標記效率受反應體系中 RNA 與 GTP 摩爾濃度比以及 RNA 樣本中 GTP 含量的影響：
（1）取適量的 RNA 至 1.5 mL 離心管中，使用無核酸酶水稀釋至 14 μL；
（2）65℃加熱 5 min，然后取出冰浴 5 min，完成變性；
（3）根據(jù)下表配制 5'末端標記反應體系：

組分	使用量
變性RNA	14 μL
10×加帽緩沖劑	2 μL
GTP mix **	2 μL
SAM （2 mM）	1 μL
牛痘病毒加帽酶（10 U/μL）	1 μL

** GTP mix 為 GTP 和少量標記物，其中GTP 使用濃度參照注意事項 3。
（4）37℃孵育 30 min, RNA 5'末端標記完成，可進行后續(xù)實驗。

儲存/保存方法

-20℃以下保存，避免反復凍融或頻繁暴露于溫度變化中，shou次使用時建議進行分裝。

技術(shù)指標

質(zhì)量控制：
核酸外切酶活性：10 U的本品和1 μg λ-Hind III digest DNA 在 37℃下反應 16 小時，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化；
核酸內(nèi)切酶活性：10 U 的本品和 1 μg λDNA在 37℃下反應 16 小時，DNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化；
切口酶活性：10 U 的本品和 1 μg pBR322 在 37℃下反應 16 小時，DNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化；
RNase活性：10 U的本品和1.6 μg MS2 RNA 在 37℃下反應 4 小時，RNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化；
大腸桿菌 DNA 殘留檢測：10 U 本品中殘留的核酸經(jīng) E.coli 16s rDNA 特異性的 TaqMan qPCR 檢測，E.coli 基因組殘留≤1 拷貝；
細菌內(nèi)毒素（Endotoxin）：LAL-Test，中國藥典 2020 版第四部凝膠限度試驗法通則（1143），細菌內(nèi)毒素含量≤10 EU/mg。

注意事項

1、反應前熱處理 RNA，去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 5'末端的二級結(jié)構(gòu)，若已知 RNA 5'末端的結(jié)構(gòu)復雜，可以延長反應時間至 60 min，以提高加帽效率；
2、用于加帽反應的 RNA 在使用之前應進行純化并溶解于無核酸酶水。溶液中不能含有EDTA 和鹽；
3、5'末端標記反應體系中， GTP 儲液應稀釋為反應體系中 mRNA 摩爾濃度的 1-3 倍；
4、反應體系體積可根據(jù)實際需求按比例進行放大或縮小。

參考文獻

[1] Mao X, Shuman S. Intrinsic RNA (guanine-7) methyltransferase activity of the vaccinia virus capping enzyme D1 subunit is stimulated by the D12 subunit. Identification of amino acid residues in the D1 protein required for subunit association and methyl group transfer. J Biol Chem. 1994;269(39):24472-24479. PMID: 7929111
[2] Grudzien E, Stepinski J, Jankowska-Anyszka M, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translational efficiency. RNA. 2004;10(9):1479-1487. PMID: 15317978
[3] Ramanathan A, Robb GB, Chan SH. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res. 2016;44(16):7511-7526. PMID: 27317694

研究領(lǐng)域
研究領(lǐng)域	Drug DiscoverymRNA Drug/Vaccine

溫馨提示：本產(chǎn)品僅作科研實驗使用，不支持臨床等研究

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