Mouse IL-6 ELISA Kit

B cell stimulatory factor-2, B-cell differentiation factor, BSF2, BSF-2, BSF2CTL differentiation factor, CDF, HGFHSFIFNB2Hybridoma growth factor, IFNB2, IFN-beta-2, IL6, IL-6, IL-6B-cell stimulatory factor 2, Interferon beta-2, interleukin 6 (interferon, beta 2), interleukin BSF-2, interleukin-6, MGI-2A,小鼠白介素6ELisa試劑盒

Mouse IL-6 ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。特異性抗小鼠IL-6抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和生wu素化的檢測(cè)抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-6與固相抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)（參考校正波長(zhǎng)540nm或570nm）測(cè)定吸光度值。

Mouse

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自備試驗(yàn)器材
1. 酶標(biāo)儀（可測(cè)量450nm檢測(cè)波長(zhǎng)的吸收值及540nm或570nm校正波長(zhǎng)的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)
5. 500mL量筒

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 樣品搜集及儲(chǔ)存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測(cè)樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)┦占獫{，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測(cè)。樣本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請(qǐng)將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測(cè)）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實(shí)際操作時(shí)可先計(jì)算使用量，再進(jìn)行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實(shí)際操作時(shí)可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計(jì)算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
③檢測(cè)抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計(jì)算所需體積。例：使用了10個(gè)孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測(cè)抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個(gè)孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測(cè)抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計(jì)算當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個(gè)稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)（1000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請(qǐng)放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請(qǐng)立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí);
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會(huì)有助于得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請(qǐng)將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL檢測(cè)抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí)；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL SA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會(huì)從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請(qǐng)輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長(zhǎng)。如果沒有使用雙波長(zhǎng)校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會(huì)受影響；
13. 計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對(duì)數(shù)與相應(yīng)OD值對(duì)數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗(yàn)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的Mouse IL-6，測(cè)定其回收率?；厥章史秶?0-114%，平均回收率在91%。
2. 靈敏度：Mouse IL-6的可測(cè)劑量（MDD）一般小于1.8pg/mL?？蓽y(cè)值是根據(jù)20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到的相對(duì)應(yīng)濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的高純度重組Mouse IL-6蛋白所校正。
4. 線性：4個(gè)不同的樣本中摻入高濃度的Mouse IL-6，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測(cè)范圍內(nèi)，測(cè)定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測(cè)天然及重組Mouse IL-6蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測(cè)與Mouse IL-6的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組Mouse IL-6對(duì)照品中，來檢測(cè)對(duì)Mouse IL-6的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。


四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無(wú)顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽(yáng)性對(duì)照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）




五、實(shí)驗(yàn)流程圖

白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一個(gè)具有α螺旋結(jié)構(gòu)，22-28kD的磷酸化和不同程度糖基化的多功能細(xì)胞因子，它在疾病急性期反應(yīng)、炎癥、造血、骨代謝以及癌癥惡化等方面起重要作用。成熟的小鼠IL-6有187個(gè)氨基酸，與人和大鼠IL-6分別有42%和85%同源性。IL-6內(nèi)部的選擇性剪接而產(chǎn)生多種異構(gòu)體，有些剪接體表現(xiàn)出拮抗特性。已知表達(dá)IL-6的細(xì)胞，包括CD8+T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、巨核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞（在內(nèi)皮素的影響下）、交感神經(jīng)元、大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞、肥大細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、胎兒及成人星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞，結(jié)腸上皮細(xì)胞、B1B細(xì)胞和胰島β細(xì)胞。IL-6的產(chǎn)生通常是在糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺和第二性類固醇的控制下，一般與細(xì)胞激活相關(guān)。正常人血液中的IL-6在1pg/mL范圍內(nèi)，在月經(jīng)期略有升高、在某些癌癥的中晚期中度增高、在大型手術(shù)后有顯著升高。
IL-6通過細(xì)胞表面受體引發(fā)細(xì)胞信號(hào)，該受體是由配體結(jié)合亞單位（IL-6受體）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)亞單位gp130組成的異二聚體復(fù)合物。IL-6結(jié)合到IL-6受體上，引發(fā)了IL-6受體與gp130的結(jié)合及gp130的二聚體化。gp130也是CLC、CNTF、CT-1、IL-11、IL-27、LIF和OSM受體的組成部分?？扇苄訧L-6受體是由選擇性剪接和蛋白酶切割產(chǎn)生的。通過反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，可溶性IL-6和IL-6受體復(fù)合可引發(fā)表面缺乏IL-6受體，但表達(dá)gp130細(xì)胞的應(yīng)答。IL-6受體的表達(dá)主要局限于肝細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和靜息淋巴細(xì)胞，由于gp130分子表達(dá)非常廣泛，反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了更廣泛的細(xì)胞類型對(duì)IL-6的響應(yīng)?？扇苄詆p130剪接體阻止了IL-6/IL-6R的反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但不能阻止其它細(xì)胞因子利用gp130分子作為共同受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
IL-6與腫瘤壞死因子α（TNF-α）和IL-1一道，所引起的急性炎癥反應(yīng)，在發(fā)熱和肝臟急性炎癥反應(yīng)中幾乎起著的作用，它在從急性炎癥到獲得性免疫或者慢性炎性疾病的轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮重要作用。IL-6失調(diào)可促進(jìn)慢性炎癥，如肥胖、胰島素抵抗、炎癥性腸道疾病、炎性關(guān)節(jié)炎以及敗血癥，往往涉及IL-6的反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β存在的情況下，IL-6在幼稚型T細(xì)胞相Th17炎性細(xì)胞分化的過程中起重要作用。IL-6調(diào)節(jié)骨吸收，通過促進(jìn)Th17炎性細(xì)胞的活性，是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中造成炎性關(guān)節(jié)損傷的主要因素。IL-6參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和非穩(wěn)定性。然而，IL-6也有抗炎癥作用，如體育鍛煉時(shí)骨骼肌分泌IL-6，它作為造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血、誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟為漿細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的永生。IL-6也促進(jìn)，但可能不會(huì)啟動(dòng)其它炎癥相關(guān)的癌癥發(fā)生，如結(jié)腸炎相關(guān)癌癥。

Mouse

未開封試劑盒，2-8°C儲(chǔ)存。

1. 請(qǐng)?jiān)谠噭┖杏行趦?nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號(hào)試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測(cè)；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基。
4. 檢測(cè)結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實(shí)驗(yàn)人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時(shí)間或溫度、試劑盒的儲(chǔ)存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時(shí)請(qǐng)做好眼鏡、手、面部及衣服的防護(hù)。