Mouse IL-1 beta ELISA Kit

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Mouse IL-1 beta ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。特異性抗小鼠IL-1β抗體預(yù)包被在高親和力的酶標(biāo)板上。酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IL-1β與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應(yīng)，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Mouse

15.6pg/mL-1000pg/mL

需自備試驗(yàn)器材
1. 酶標(biāo)儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)
5. 500mL量筒

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1. 樣品搜集及儲存
①細(xì)胞培養(yǎng)上清：顆粒物應(yīng)通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時(shí)檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時(shí)檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血?jiǎng)┦占獫{，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時(shí)檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實(shí)驗(yàn)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做復(fù)孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實(shí)際操作時(shí)可先計(jì)算使用量，再進(jìn)行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實(shí)際操作時(shí)可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計(jì)算所需的稀釋用緩沖液用量，再進(jìn)行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計(jì)算所需體積。例：使用了10個(gè)孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個(gè)孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計(jì)算當(dāng)次試驗(yàn)所需要用量，取出相應(yīng)體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當(dāng)日使用。
⑥標(biāo)準(zhǔn)品：凍干標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個(gè)稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標(biāo)準(zhǔn)品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品母液可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)（1000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)（0pg/mL）。

二、操作步驟
1. 準(zhǔn)備好所有需要的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)樣本或者質(zhì)控品加入相應(yīng)孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí);
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動(dòng)洗板機(jī)洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復(fù)操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫孵育2小時(shí)；
7. 重復(fù)第5步洗板操作；
8. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL SA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復(fù)第5步洗板操作；
10. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個(gè)微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍(lán)色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀測量450nm的吸光度值，設(shè)定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準(zhǔn)確度可能會受影響；
13. 計(jì)算結(jié)果：將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復(fù)孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標(biāo)準(zhǔn)品OD值。使用計(jì)算機(jī)軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。另一種方法是，可以通過繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度做對數(shù)與相應(yīng)OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個(gè)過程可生成一個(gè)足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應(yīng)根據(jù)同次試驗(yàn)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細(xì)胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的Mouse IL-1β，測定其回收率?；厥章史秶?9-102%，平均回收率在77%。
2. 靈敏度：Mouse IL-1β的可測劑量（MDD）一般小于3.8pg/mL。可測值是根據(jù)20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線零點(diǎn)吸光值的平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算得到的相對應(yīng)濃度。
3. 校正：此 ELISA 試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的高純度重組Mouse IL-1β蛋白所校正。
4. 線性：4個(gè)不同的樣本中摻入高濃度的Mouse IL-1β，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。


5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組Mouse IL-1β蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配置成50ng/mL的濃度來檢測與Mouse IL-1β的交叉反應(yīng)。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組Mouse IL-1β對照品中，來檢測對Mouse IL-1β的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)或干擾。





四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標(biāo)本孔OD值明顯偏高）

五、實(shí)驗(yàn)流程圖

白細(xì)胞介素1（IL-1）蛋白家族包含經(jīng)典成員IL-1α、IL-1β和IL-1ra，以及IL-18、IL-33和IL-1F5-10。IL-1α和IL-1β結(jié)合于相同的細(xì)胞表面受體，共享生物學(xué)功能。除了皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、一些上皮細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些細(xì)胞之外，健康小鼠未刺激的細(xì)胞不產(chǎn)生IL-1。但是，作為對炎癥物質(zhì)、感染或微生物內(nèi)毒素的應(yīng)答，巨噬細(xì)胞以及其他多種細(xì)胞會大量產(chǎn)生IL-1。在免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)、骨重建、發(fā)熱、糖代謝、生長激素/IGF-1的生理學(xué)過程中，IL-1β起著關(guān)鍵作用。在一系列的病理?xiàng)l件下，包括敗血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、急性和慢性髓性白血病、胰島素依賴型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)損傷以及衰老有關(guān)的疾病，一直伴有IL-1的異?；虺掷m(xù)產(chǎn)生。
IL-1α和IL-1β具有結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽，在氨基酸水平上的同源性大約為25%。它們均被合成為31kDa大小的前體，然后裂解為成熟的蛋白質(zhì)，分子量大約為17.5kDa。Caspase-1/ICEI裂解IL-1β前體是炎癥反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。IL-1α和IL-1β都不含有典型的疏水性信號肽，但有證據(jù)表明這些因子可通過非經(jīng)典通路分泌。一部分未加工的IL-1α可在細(xì)胞膜上出現(xiàn)，并可能存有生物學(xué)活性。與IL-1α前體不同，IL-1β前體與成熟體相比幾乎不具備生物學(xué)活性。未加工和成熟的IL-1β均可從細(xì)胞輸出。
IL-1α和IL-1β通過與IL-1ra結(jié)合的免疫球蛋白超家族受體發(fā)揮作用。表達(dá)80kDa的跨膜I型受體（IL-1RI）的細(xì)胞包括：T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、滑液內(nèi)層細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肝細(xì)胞。表達(dá)68kDa的跨膜II型受體（IL-1RII）的細(xì)胞包括：B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。這兩種IL-1受體的胞外域具有大約28%的同源性，但顯著差異則體現(xiàn)在其胞內(nèi)域：II型受體的胞內(nèi)域僅有29個(gè)氨基酸，而I型受體的胞內(nèi)域卻有217個(gè)氨基酸。IL-1RII對于IL-1不產(chǎn)生信號，可能做一個(gè)誘騙受體減弱IL-1功能。IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAcP）與IL-1RI相關(guān)，為IL-1RI信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需。IL-1ra是一個(gè)分泌性分子，起到IL-1競爭性抑制劑的作用。在人血漿、關(guān)節(jié)滑液以及多種人細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中可以檢出可溶性IL-1RI和IL-1RII。此外，類似于可溶性IL-1RII的IL-1結(jié)合蛋白能夠由牛痘和牛痘病毒編碼產(chǎn)生。

Mouse

未開封試劑盒，2-8°C儲存。

1. 請?jiān)谠噭┖杏行趦?nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高值，應(yīng)將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑（1×）稀釋外，其它中間稀釋可采用細(xì)胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實(shí)驗(yàn)人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術(shù)、反應(yīng)時(shí)間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時(shí)請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護(hù)。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。