B-27添加劑 (50x)

 

50×

1、wan全培養(yǎng)基制備
（1）置于4°C解凍本產(chǎn)品。
（2） 在使用前無菌添加2%本產(chǎn)品和0.5 mM L-gu氨酰胺至神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制成神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基（注：下文中出現(xiàn)的“神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基"即指此種添加了B-27添加劑和L-gu氨酰胺的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基）注意：剩余的本產(chǎn)品可以等分成工作體積，并儲存在-30 ~ -5℃。在以后的試驗中根據(jù)需要解凍相應(yīng)體積的本產(chǎn)品。避免反復(fù)凍融。
（3）對于原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)，神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基（由前述步驟制備）需要額外補充25 μM的L-谷氨suan，在培養(yǎng)的第4天以后的換液中應(yīng)不再添加谷氨suan。配置好的wan全培養(yǎng)基，可于2-8℃的避光保存一周。
2、細胞培養(yǎng)步驟
下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經(jīng)元，以及神經(jīng)母細胞瘤細胞系中測試。
（1）用無菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養(yǎng)表面(玻璃或細胞培養(yǎng)級塑料)，每平方厘米表面使用0.15 mL，在室溫下保溫1 h。
（2）去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須che底清洗，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養(yǎng)板的蓋子通風(fēng)，直到每個孔都wan全干燥。培養(yǎng)板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。
（3）根據(jù)標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經(jīng)元或解凍凍存的原代大鼠神經(jīng)元。
（4）在預(yù)熱的(37°C)神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基中（如前所述的方法制備)接種細胞，建議的細胞密度為160個細胞/mm2，或必要時使用自行優(yōu)化的細胞密度。注意：對于海馬神經(jīng)元，培養(yǎng)基中須添加25μM L-谷氨suan，參見“wan全培養(yǎng)基的制備"。
（5）在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）。
（6）培養(yǎng)4-24小時后，更換一半體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（7）對海馬神經(jīng)元以外的細胞：在接種4天后，更換一半體積的新鮮的wan全培養(yǎng)基，之后每三天重復(fù)一次。對海馬神經(jīng)元：接種三天后，用不含L-谷氨suan的新鮮培養(yǎng)基更換一半體積的培養(yǎng)基。之后每三天重復(fù)一次。注意：在wan全培養(yǎng)基中添加25 µM 2-巰ji乙醇，可改善海馬神經(jīng)元的長期存活率。
3、分離原代大鼠胚胎神經(jīng)元
下列程序推薦用于培養(yǎng)受精18天的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元和大腦皮層神經(jīng)元。
（1）從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側(cè)海馬
（2）在預(yù)置了Hibernate-Ewan全培養(yǎng)基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。
（3）使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養(yǎng)基。
（4） 在不含鈣離子的Hibernate-E培養(yǎng)基中，使用2 mg/mL過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在30°C酶解組織大約30 min，其間每5 min輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用2 mL酶溶液。
（5）加入兩倍體積的Hibernate-Ewan全培養(yǎng)基以恢復(fù)二價陽離子的濃度，停止酶解。
（6）使未解離的組織沉降至管底（約2 min），然后把上清液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，以150×g離心5 min。
（7）在1 mL神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基中重懸沉淀物，取一小份(例如10 μL)進行細胞計數(shù)。后續(xù)的操作按照“復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元"的第8-10步驟進行。
4、復(fù)蘇和培養(yǎng)凍存的神經(jīng)元
重要提示：原代神經(jīng)元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內(nèi)表面，以獲得最高的回收率和產(chǎn)量。由于細胞從凍存狀態(tài)復(fù)蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞。我們建議每次只解凍一管細胞。務(wù)必減少從液氮中轉(zhuǎn)移凍存管到37°C水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中，可在冰桶中放少量液氮，將細胞置于這個冰桶中來進行。
（1）在解凍細胞之前，用神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基沖洗無菌的15 mL錐形管，然后在超凈工作臺中通風(fēng)晾干。
（2）從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。
（3） 在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（小于2 min）。當觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出。
（4）在超凈工作臺中用70%的異丙醇消毒凍存管。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內(nèi)液體沉降到管底。
（5） 使用事先用神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基沖洗并干燥過的1 mL吸頭極其輕柔地將細胞轉(zhuǎn)移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中。
（6）用1 mL預(yù)熱的神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉(zhuǎn)動錐形管一次。不要一次即把全部培養(yǎng)基加到錐形管中。
（7）慢慢地逐滴加入另外2 mL預(yù)熱的wan全培養(yǎng)基，使管內(nèi)的液體體積為4 mL。用1 mL吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。
（8）用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取10 μL細胞懸液加入到含有10 μL 0.4%臺盼藍的微量離心管中，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細胞計數(shù)方法測定活細胞密度。解凍的細胞的活率應(yīng)超過50%。
（9）在已經(jīng)事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養(yǎng)步驟"）的48孔板中每孔中接種大約1×105個細胞或按所需的細胞密度接種。加入預(yù)熱的神經(jīng)元wan全培養(yǎng)基將細胞懸液稀釋到每孔500 μL。
（10）按照“細胞培養(yǎng)步驟"中的5-6步驟進行神經(jīng)元的培養(yǎng)。在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環(huán)境）。

-20℃，有效期24個月。

B-27添加劑 (50x)用于組織和細胞的體外培養(yǎng)。

B-27 無血清添加劑

淡粉色澄清液體