SDS裂解液

SDS 細胞裂解液由SDS、Tris-HCl 等組成，本試劑未加入蛋白酶抑制劑成分，請依據(jù)文獻要求自行添加。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于 PAGE 電泳，Western，免疫沉淀 (Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。不宜用 Bradford 法測定由SDS 細胞裂解液獲得樣本的蛋白濃度。產(chǎn)品組分：

一、貼壁培養(yǎng)細胞

1、取SDS Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、去除培養(yǎng)液，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次，低速離心，棄上清，留取沉淀。

3、按照 6 孔板每孔加入 150～250uL 含有 PMSF 的裂解液的比例加入SDS Lysis Buffer。移液器輕輕吹打，使裂解液和細胞充分接觸。置于冰上或 4℃裂解，通常裂解液作用于細胞 1～3s 內(nèi)，細胞就會被裂解。通常 6 孔板每孔細胞加入 150uL 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200～250uL。

4、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5、進行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

二、懸浮培養(yǎng)細胞

1、取SDS Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻后加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、低速離心懸浮細胞，棄上清，收集沉淀。

3、用手指輕彈細胞，使其松散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150～250uL 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入SDS Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔細胞加入 150uL 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200～250uL。

4、10000～12000g， 4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

5、進行后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

三、組織樣本

1、取SDS Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻后加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM。

2、把組織jian切成細小的碎片，越小越好。

3、取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

4、按照每20mg組織加入150～250uL裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解 15～30min。

5、步驟 3、4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 150～250uL 裂解液的比例加入含有 PMSF 的SDS Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，該過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解。

6、10000～12000g，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可)，取上清。

7、進行后續(xù)的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事項：

1、去除貼壁細胞的培養(yǎng)液后，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。

2、如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。

3、如果細胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細胞/離心管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。

4、如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈 Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

5、溶解SDS Lysis Buffer 時，應盡量縮短溶解時間，避免裂解液中的有效成分失效。

6、裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復合物。在不檢測和基因組 DNA 結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗。如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。