Human IFN-gamma ELISA Kit

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Human IFN-gamma ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術。特異性抗人IFN-γ抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生uw素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的IFN-γ與固相抗體和檢測抗體結(jié)合，形成免疫復合物。洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

9.38pg/mL-600pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品搜集及儲存
①細胞培養(yǎng)上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色劑：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為600pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（600pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。
二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結(jié)果。最后一次洗板結(jié)束，請將板內(nèi)所有液體吸干或?qū)宓怪?，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結(jié)果準確度可能會受影響；
13. 計算結(jié)果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數(shù)與相應OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標準曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應根據(jù)同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的人IFN-γ，測定其回收率?；厥章史秶?0-116%，平均回收率在103%。
2. 靈敏度：人IFN-γ的zui低可測劑量（MDD）一般小于7.8pg/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此ELISA試劑盒經(jīng)大腸桿菌表達的高純度重組人IFN-γ蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的人IFN-γ，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組人IFN-γ蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成 50ng/mL的濃度來檢測與人IFN-γ的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組人IFN-γ對照品中，來檢測對人IFN-γ的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。與重組恒河猴 IFN- γ 有大約 20%的交叉反應。



四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

γ干擾素（又稱為II型干擾素）是一個重要的能行使免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子。它因其抗病毒活性而被發(fā)現(xiàn)。γ干擾素通過抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)功能在宿主防御中扮演關鍵角色。在多種類型的細胞中，γ干擾素可誘導細胞因子的產(chǎn)生和上調(diào)不同的膜蛋白的表達，包括I/II型主要組織相容性復合體（MHC-I，MHC-II）、Fc受體、白細胞粘附分子、B7家族抗原。γ干擾素能有效活化巨噬細胞、指導B細胞免疫球蛋白的合成、類型轉(zhuǎn)化和分泌。γ干擾素也能通過抑制Th2的分化和刺激Th1的生長而影響T輔助細胞亞型的發(fā)育。γ干擾素在自身免疫和動脈粥樣硬化癥等一些炎癥性疾病過程中起著重要作用。
生物活性的γ干擾素是一個非共價結(jié)合的二聚體，其分子量約為20-25KD，有不同程度的糖基化。成熟的人γ干擾素與恒河猴的γ干擾素氨基酸序列同源性接近90%，與牛、犬、馬、貓和豬的γ干擾素有59-64%的同源性，與棉鼠、小鼠和大鼠的γ干擾素同源性為37-43%。干擾素二聚體先與跨膜受體IFN-γRI（α亞基）結(jié)合，再與IFN-γRII（β亞基）結(jié)合形成一包含了兩個α亞基和兩個β亞基的功能性復合體；其中復合受體中的IFN-γRII可以增加配體的親和力以及信號轉(zhuǎn)導效率。盡管γ亞基在很多類型細胞上有組成型表達，但β亞基細胞表達的調(diào)節(jié)受體γ干擾素反應狀態(tài)的影響，并被嚴格調(diào)控。
γ干擾素在一系列炎癥條件下可由許多的細胞分泌，包括樹突狀表皮/γ δ T細胞、角化細胞、外周血γ δ T細胞、肥大細胞、神經(jīng)元、CD8+T細胞、巨噬細胞、B細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞，CD4+T細胞和睪丸精子細胞等等。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲存。

1. 請在試劑盒有效期內(nèi)使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結(jié)果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。