Human VEGF ELISA Kit

MVCD1, VAS, vascular endothelial growth factor A, Vascular permeability factor, Vasculotropin, VEGF, VEGFA, VEGF-A, VEGFMGC70609, VPF, VPFvascular endothelial growth factor

Human VEGF ELISA Kit采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測技術。特異性抗人VEGF抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經過孵育，樣本中存在的VEGF與固相抗體和檢測抗體結合，形成免疫復合物。洗滌去除未結合的物質后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm)測定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品搜集及儲存
①細胞培養(yǎng)上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內離心15分鐘，轉速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據樣本稀釋倍數，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色劑：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色劑，避光；取出的顯色劑僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為2000pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（2000pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。



二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內加入50uL終止液，孔內溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13. 計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數與相應OD值對數生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數據擬合。若樣本經過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
注：提供的標準曲線數據僅供參考，應根據同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數
1. 回收率：在細胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的Human VEGF， 測定其回收率。 回收率范圍在113-135%，平均回收率在121%。 
2. 靈敏度：Human VEGF的zui低可測劑量（MDD）一般在7.8pg/mL。zui低可測值是根據20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此 ELISA 試劑盒經sf-21昆蟲細胞表達的高純度重組Human VEGF蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的Human VEGF，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內，測定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組Human VEGF蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配置成50ng/mL的濃度來檢測與Human VEGF的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組Human VEGF對照品中，來檢測對Human VEGF的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。含濃度3125pg/mL 的重組Human VEGF165/PlGF 異二聚體有23%交叉反應性，含濃度312.5pg/mL 的 重組犬 VEGF 有 41.2%交叉反應性，重組Human VEGF R1( Flt- 1)/Fc 嵌合體和 rhVEGF R2 (KDR)/Fc 嵌 合體在濃度為>781 pg/mL 和12.5 ng/mL 發(fā)生干擾。

四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

血管內皮生長因子（VEGF或VEGF-A）又叫血管通透因子，是一種針對胎兒和成人的血管新生和血管生成的有效調節(jié)因子。血管內皮生長因子屬于PDGF家族，該家族蛋白的特點是在胱氨suan結和通過反向平行二硫鍵結合的二聚體的結構處，存在8個保守的胱氨suan殘基。經過選擇性剪切和氨基酸的序列長度，人類表達不同的亞型，包括：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206等。其中VEGF165是表達量最高的一種亞型，其次是VEGF121和VEGF189。除了VEGF121，其它的亞型都包含了基本的肝素結合區(qū)域且不能自由擴散。人類的VEGF165與小鼠和大鼠的相應的蛋白氨基酸序列同源性為88%。VEGF在各種細胞和組織中表達，包括骨骼肌細胞和心肌細胞、肝細胞、成骨細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、角質形成細胞、棕色脂肪細胞、CD34+干細胞、內皮細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞等。VEGF的表達收到缺氧和細胞因子的誘導，包括IL-1、IL-6、IL-8、抑瘤素M和腫瘤壞死因子α等。在發(fā)育過程和成體中，VEGF的表達量也是不同的。
VEGF的二聚體與2個相關的酪氨suan激酶受體相結合，即VEGFR1（也叫Flt-1）和VEGFR2（Flk-1/KDR）。VEGF同時可以誘導后者的同型二聚體和自磷酸化過程。這些受體擁有7個胞外的免疫球蛋白的域和一個胞內分開的酪氨suan受體域。血管內皮細胞和其它一些非內皮細胞都表達VEGF受體。盡管VEGF與VEGFR1的親和力最高，但VEGFR2卻是調控VEGF的血管生成的主要因子。VEGF165也結合臂板蛋白（semaporin）受體，神經纖毛蛋白1（Neuropilin-1），由此促進與VEGFR2的復合體形成。
VEGF因其參與血管生成而著稱。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF調控內皮細胞的增殖、遷移和生存，并由此調控血管的密度、體積；但對于血管形成的格局并不起作用。VEGF通過成骨細胞和軟骨細胞的招募促進骨骼的形成，它同時也是一個單核細胞趨化因子。在產后，VEGF維持血管內皮細胞的完整性，并且是大/小血管內皮細胞的有效絲裂原。在成體中，VEGF主要在傷口修復和女性的生殖周期發(fā)揮作用。在疾病組織當中，VEGF促進血管的通透性。因此，VEGF通過外滲和腫瘤血管生成參與了腫瘤的轉移過程。針對阻斷VEGF活性的各種治療策略正 在被用于控制由VEGF誘導的腫瘤血管生成。體內循環(huán)的VEGF水平與自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等）的病癥程度相關。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲存。

1. 請在試劑盒有效期內使用。
2. 不同試劑盒及不同批號試劑盒的組分不能混用。
3. 樣本值若大于標準曲線的最高值，應將樣本用稀釋劑（1×）稀釋后重新檢測；若細胞培養(yǎng)上清液樣本需分布稀釋，除最后一步用稀釋劑稀釋外，其它中間稀釋可采用細胞培養(yǎng)基。
4. 檢測結果的不同可由多種因素引起，包括實驗人員的操作、移液器的使用方式、洗板技術、反應時間或溫度、試劑盒的儲存等。
5. 試劑盒中的終止液是酸性溶液，使用時請做好眼鏡、手、面部及衣服的防護。
6. 僅供科研使用，不可用于體外診斷。