免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液

免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液（Lysis Buffer for WB/IP Assays）是在非變性環(huán)境內(nèi)裂解細胞的一款裂解液，主要成分為 20mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，以及焦磷酸鈉，β-甘油磷酸，正釩酸鈉，EDTA 和yi肽酶等多種抑制劑，可廣譜且有效抑制蛋白降解，并且維持原先蛋白間相互作用。經(jīng)本品裂解所得的蛋白樣品，適用于 PAGE，蛋白免疫印跡（Western Blot），免疫沉淀（IP），免疫共沉淀，ELISA 等實驗。經(jīng)本品裂解收集的蛋白樣品，可使用增強型 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。由于本品含有較高濃度的 Triton X-100 等干擾物質(zhì)，不適合用 Bradford法來測定總蛋白濃度。

免疫印跡及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液產(chǎn)品組分

1、試劑準備：

取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)將磷酸酶抑制劑按照1:50 加入裂解液中，加入100mM 的PMSF并使PMSF 的最終濃度為1mM。

2、細胞／組織的裂解：

對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗—遍。按照 6 孔板每孔加入 150-250µL 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞 1-2 秒后，細胞就會被裂解。如果用于 ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解 10 分；

對于懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照 6 孔板每孔細胞加入150-250µL 裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。如果細胞量較多，必需分裝成 50-100 萬細胞/管，然后再裂解。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。如果用于ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解 10 分鐘。

對于組織樣品：用組織jian將組織jian成碎片后，按照每 20mg 組織加入 150-250µL 裂解液的比例加入裂解液，并使用用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。如果用于 ChIP，初步裂解后需在冰浴上繼續(xù)裂解 10 分鐘。

3、蛋白樣品收集：

充分裂解后，10000-14000g 離心 3-5 分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的 PAGE、Western 和 lP 等操作。