七色多重熒光免疫組化染色試劑盒（plus）

多色試劑盒

多重熒光免疫組化染色是基于抗原、抗體特異性結合的原理，選用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗抗體，對試劑盒中的熒光染料進行活化，將信號共價結合到抗原上。借助于不同的熒光染料標記，通過多輪染色循環(huán)實現(xiàn)組織或細胞的原位多靶點染色。

主要用于組織、石蠟切片、TMA芯片的免疫組化染色。也可用于冰凍切片和細胞爬片，需搭配abs994 抗體洗脫液（mIHC專用）。

一、樣本要求
1、福爾馬林固定的蠟塊或玻片，大塊組織或TMA，封蠟不能有明顯的破損。
2、玻片樣本，組織需要緊貼玻片，避免褶皺，玻片不能有破損、劃傷或污漬。
3、組織最小應包含大于1000個細胞。
4、蠟塊需包埋實體瘤組織，壞死瘤組織、細針穿剌物、細胞甩片樣品會影響染色效果。
5、組織應當用10%中性福爾馬林固定，正常固定時間為18-24h。
6、切片厚度為4um左右，使用防脫玻片。建議玻片在固定后一周內制備為佳。
7、不要在水浴撈片環(huán)節(jié)添加任何粘合劑，樣本應置于玻片正面、中央。將撈片豎直置于吸水紙上去除水分，輕敲去除水滴，不要用紙擦拭玻片。
8、玻片置于45℃熱盤上放置30min（自然風干玻片時長不小于1h）。

二、檢驗方法
1、所需儀器設備：移液器、恒溫干燥箱、微波爐、免疫組化筆、修復杯、染色缸、計時器、孵育濕盒、蓋玻片、通風櫥、洗瓶、熒光顯微鏡、量筒100ml、量筒1000ml等。
2、所需試劑：滅菌去離子水（abs9259）、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、10%中性福爾馬林、抗原修復一抗、封閉液、TBST等。
3、試劑準備：
1）熒光染料的稀釋：染料為100×母液，使用信號放大反應液按1:100稀釋制備染料工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；DAPI使用無菌水按1:100稀釋制備工作液。
2）二抗的使用：試劑盒為鼠兔通用二抗，不建議樣本與二抗同源，實驗前請核實一抗種屬是否匹配。
4、檢測設備：熒光顯微鏡或熒光全片掃描設備，TSA單色熒光染料適用的激發(fā)和發(fā)射濾光片應符合表中的建議。

三、石蠟切片操作步驟
1、脫蠟水合
a）新鮮二甲苯浸片10min，重復3次。
b）梯度乙醇浸片：100% 5min；95% 5min；70% 2min。
c）滅菌水洗片1min，重復3次。
d）10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛浸片10-30min，滅菌水洗片1min，重復3次。（可選項，視樣本質量而定）
e）滴加破膜劑通透15min，PBST浸洗3min，重復3次。（可選項，一般情況下可不做）
2、微波修復抗原
a）將脫蠟水合后的玻片置于修復杯中，用抗原修復液1×工作液浸沒。
b）將修復杯置于微波爐內高火煮沸。
c）低火維持15min（注意補液，防止蒸發(fā)過度導致干片）。
d）取出室溫自然冷卻至室溫。
3、淬滅和封閉
a）去除玻片上殘存洗液。
b）用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加3%過氧化氫覆蓋樣本區(qū)域，孵育10min，PBST浸洗3min，重復3次。
c）去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。
4、一抗孵育
a）去除玻片上的封閉液。
b）用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。
c）室溫保濕震蕩孵育1h（需針對不同抗體做優(yōu)化調整）。
d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復1次。
5、二抗孵育
a）去除玻片上殘存的洗液。
b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸沒樣本區(qū)域。
c）室溫保濕孵育10min。
d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復1次。
6、熒光染色放大信號
a）去除玻片上殘存的洗液。
b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信號放大液按1:100稀釋）浸沒樣本區(qū)域。
c）室溫保濕震蕩孵育10min。
d）1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3min。重復3次。
e）微波修復，室溫自然冷卻至室溫。
f）滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。
7、新一輪染色（單染可直接進行第8步）
a）每輪染色結束后可用熒光顯微鏡確認染色情況，注意用TBST覆蓋樣品，防止干片。
b）封閉：去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。（無需淬滅步驟）
c）重復步驟4-6
d）多輪染色重復步驟7，a）— c）結束后進行染核及封片
8、染核及封片
滴加1×DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡，長期保存請用透明指甲油對蓋玻片邊緣進行密封。
9、閱片，對染色后的組織片在熒光顯微鏡下觀察并分析。

四、冰凍切片操作步驟（需搭配抗體洗脫液abs994）

1、淬滅、通透、封閉

a）從冰箱中取出冷凍玻片，恢復至室溫，PBST浸洗3min，重復3次

b）10%中性福爾馬林或4%多聚甲醛浸片10-30min，滅菌水洗片1min，重復3次。（可選項，視樣本質量而定）

c）滴加破膜劑通透15min，PBST浸洗3min，重復3次。（可選項，一般情況下可不做）

d）用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加3%過氧化氫覆蓋樣本區(qū)域，孵育10min，PBST浸洗3min，重復3次。

e）去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。

2、一抗孵育

a）去除玻片上的封閉。

b）用移液器滴加稀釋的一抗溶液，浸沒樣本區(qū)域。

c）室溫保濕震蕩孵育1h（需針對不同抗體做優(yōu)化調整）。

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復1次。

3、二抗孵育

a）去除玻片上殘存的洗液。

b）直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸沒樣本區(qū)域。

c）室溫保濕孵育10min。

d）用1×TBST buffer浸洗玻片3min，重復1次。

4、熒光染色放大信號

a）去除玻片上殘存的洗液。

b）用移液器在玻片上滴加1×染料工作液100ul（使用信號放大液按1:100稀釋）浸沒樣本區(qū)域。

c）室溫保濕震蕩孵育10min。

d）1×TBST buffer浸洗玻片，室溫浸片3min。重復3次。

e）滴加抗體洗脫液（abs994），37℃孵育15-20min。

f）滅菌水洗片1次，1×TBST buffer浸片2min。

5、新一輪染色（單染可直接進行第6步）

a）每輪染色結束后可用熒光顯微鏡確認染色情況，注意用TBST覆蓋樣品，防止干片。

b）封閉：去除玻片上殘存洗液，滴加封閉液，覆蓋樣本區(qū)域，室溫保濕震蕩10-30min，除去封閉液。

c）重復步驟2-4。

d）多輪染色重復步驟5，結束后進行染核及封片。

6、染核及封片

滴加1×DAPI工作液到樣品上，浸沒樣本區(qū)域，室溫孵育5min。用1×TBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗熒光淬滅封片劑，用蓋玻片封片，避免氣泡，長期保存請用透明指甲油對蓋玻片邊緣進行密封。

7、閱片，對染色后的組織片在熒光顯微鏡下觀察并分析。

五、結果說明：

1、微波修復抗原、孵育時間、溫度的改變均有可能得出錯誤結果。

2、在每次染色過程中，必須有組織陽性對照和試劑陰性對照實驗同時進行。

3、若陽性組織對照不能顯示陽性染色，則應判定該批次樣本的檢測結果無效。

六、產品性能指標：

1、符合性：取符合性組織片（包括陽性組織片和陰性試劑對照），經(jīng)相應的免疫組化試驗后，陽性對照染色結果為陽性，陰性對照染色結果為陰性。

2、批內重復性：取同一批次的試劑盒，檢測同一組織切片3片，染色結果應一致。
多重熒光免疫組化（mIHC）實驗操作演示視頻
七、染料信息表格

八、其他產品推薦

熒光染料需避光保存，2～8℃儲存，收到貨起有效期為12個月。

1、本試劑盒只用于免疫組化，不做其他用途。
2、本試劑盒僅限于專業(yè)人員使用。
3、應采用適當?shù)姆雷o措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。
4、超過有效期的試劑活性可能降低，因此不得使用超過有效期的試劑。
5、若將本試劑盒的染色組分與其他公司的產品混合使用，在染色過程中可能出現(xiàn)異常情況。
6、脫蠟不che底，容易影響染色效果。
7、為了防止可能出現(xiàn)的假陰性、假陽性結果，實驗過程中需有陽性對照及陰性對照同時進行。
8、使用本試劑盒中所產生的各種廢棄物都應按照《醫(yī)療廢物管理條例》進行處理。

1. Mingzhu Yang, et al., Chemical-induced chromatin remodeling reprograms mouse ESCs to totipotent-like stem cells. Cell Stem Cell. 2022 Mar 3
2. Xin Guan, et al., Nanoparticle-enhanced radiotherapy synergizes with PD-L1 blockade to limit post-surgical cancer recurrence and metastasis. Nature Communication. 2022 May 20
3. Qian-Yue Zhang, et al., Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto’s thyroiditis. Nature Communications. 2022 Feb 9
4. Dabbs David J. 診斷免疫組織化學(M). 北京：北京大學醫(yī)學出版社，2008.9.
5. 美】Ed Harlow, David Lane. 抗體技術指南(M). 北京：科學出版社，2002:79-80,105.
6. Stack, E. C., et al., Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58.
7. 錢幫國. 焦磊. 多標記免疫熒光染色及多普成像技術在組織學研究中的應用. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2017 (4): 373-382.